【摘要】  目的 构建pcDNA3.1(-)/hURAT1真核表达重组体.方法 提取人全血基因组DNA,进行PCR扩增,将纯化的扩增产物与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞.重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ酶切后,应用核苷酸序列测定方法进行鉴定.结果PCR扩增得到hURAT1第2外显子至第5内含子长1 958 bp的基因片段.该片段与表达载体pcDNA3.1(-)连接后转化DH5α感受态细胞.重组质粒经酶切和核苷酸序列测定方法鉴定,证实hURAT1片段插入序列和方向正确.结论 hURAT1基因组DNA片段插入真核表达载体pcDNA3.1(-)的序列和方向正确,可用于后续基因功能研究,尤其是编码序列和内含子序列变异的功能研究.
　　【关键词】  人尿酸盐转运子1;pcDNA3.1(-);基因;克隆,分子;内含子;高尿酸血症
　　[ABSTRACT] Objective To construct the recombinant eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-)/hURAT1.  MethodsTotal genome DNA was prepared from normal human total blood. DNA was then subjected to PCR amplification. PCR product was cloned into pcDNA3.1(-) and then the recombinant vector transformed into  DH5α Ecoli. Constructed pcDNA3.1(-)/hURAT1 was identified by restricting enzyme digestion analysis and DNA sequencing. Results A 1 958 bp fragment, including exon 2 to intron 5 of hURAT1 genome DNA, was obtained by PCR amplification. BamHⅠ and EcoRⅠrestriction enzyme digestion and DNA sequencing confirmed with the correct sequence and direction. The pcDNA3.1(-)/hURAT1 had been successfully constructed. Conclusion The fragment of hURAT1 with correct sequence and direction is cloned into the eukaryotic expression vector pcDNA3.1(-), and it can be applied to gene function research in the future, especially to the mutation function research in the CDS or intron.
　　[KEY WORDS] hURAT1; pcDNA3.1(-); Gene; Cloning, molecular; Introns; Hyperuricemia
　　人尿酸盐转运子1(hURAT1)是维持血尿酸水平的关键离子通道,是原发性高尿酸血症和痛风的重要候选基因,其基因变异与原发性高尿酸血症和痛风发病密切相关[1].其基因位于11q13,含有10个外显子和9个内含子,cDNA 全长2 642 bp,编码区长1 659 bp,编码555个氨基酸[2].Pubmed SNP检索结果显示,大多数SNP位点位于第2外显子与第5内含子之间,共78个,其中相当数量SNP位点位于内含子区域,而且与尿酸代谢异常高度相关[2~5].然而,国内外相关研究均为关联性研究和基因编码序列的功能研究,缺乏内含子功能研究.hURAT1 mRNA主要在人肾小管上皮细胞中特异性表达,临床上得到含有待研究SNP位点肾脏标本的概率很小,所以体外重组体的构建及其在真核细胞中的表达成为研究hURAT1基因突变或SNP影响基因转录或翻译的主要手段.本文应用PCR方法对hURAT1第2外显子至第5内含子之间基因组DNA序列进行扩增,然后克隆到真核表达载体pcDNA3.1(-),构建pcDNA3.1(-)/hURAT1重组体,为今后研究该基因变异对表达的影响奠定基础,从而可以进一步解释hURAT1与尿酸代谢异常之间的关系.
　　1       材料与方法
　　1.1       主要试剂和仪器
　　基因组DNA提取试剂盒(TAKARA公司)、KOD DNA聚合酶(TOYABO公司)、QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN公司)、pGEMT Easy Vector(PROMEGA公司)、T4 DNA 连接酶(PROMEGA公司)、胰蛋白胨(SANGON公司)、酵母提取物(SANGON公司)、琼脂(SANGON公司)、氨苄青霉素(SANGON公司)、限制性内切酶(FERMENTAS公司)、pcDNA3.1(-) Vector(INVITROGEN公司)、DH5α感受态细胞(TIANGEN公司)、质粒小规模抽提试剂盒(AXYGEN公司)、质粒中规模抽提试剂盒(QIAGEN公司).PTC225型高通量PCR仪(MJR公司)、UVP凝胶成像仪(BIORAD公司)、MIR 262 恒温孵箱(SANYO公司)、低温离心机(EPPENDORF公司)、BioRAD 电泳仪(BIORAD公司)、DU650型紫外线分光光度计(EPPENDORF公司)、超净工作台(Class Biological Safety Cabinet Ⅱ,BAKER公司).
　　1.2       PCR扩增
　　按照基因组DNA提取试剂盒说明提取正常人全血DNA.以Gene Bank公布的hURAT1基因组DNA序列为模板,并根据所要构建的表达载体要求在5′和3′端引入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点,扩增包含第2外显子至第5内含子在内的一段序列.所有引物由上海生工生物技术有限责任公司合成(见表1).应用多重PCR方法,首先扩增片段①,使用1FBAMH和1R作为引物,扩增条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性 40 s,66 ℃退火 40 s,68 ℃延伸1 min30 s,35个循环;68 ℃终延伸 10 min.其次扩增片段②,使用2F和2RECOR引物,扩增条件:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 40 s,68 ℃退火 40 s,68 ℃延伸 50 s,35 个循环;68 ℃终延伸 10 min.最终以片段①和片段②PCR产物1∶1混合为模板,扩增目的片段,使用1FBAMH和2RECOR引物,扩增条件:94 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 40 s,64 ℃退火 1 min 10 s,68 ℃延伸 2 min,35个循环;68 ℃终延伸10 min.琼脂糖凝胶电泳,紫外线凝胶检测仪检测结果.PCR产物用DNA纯化试剂盒进行回收,定量,分装,一20 ℃贮存.表1       PCR扩增hURAT1基因组DNA片段引物引物名称引物序列
　　1.3       重组体的构建
　　1.3.1       pGEMT Easy Vector/ hURAT1重组体的构建       ①连接:将末端加入dATP的扩增片段与pGEMT Easy Vector按照摩尔比 3~8∶1 于 4 ℃下连接 12 h.②转化:将上述连接反应产物 5 μL加入50 μL的DH5α感受态菌液中,轻轻混匀,冰浴5~30 min;42 ℃热休克 30 s.立即置冰浴中,加入2×YT培养基900 μL,然后37 ℃水平振摇培养45 min(150 r/min);取适量的上述转化菌液涂布于预热的2×YT培养板(含氨苄青霉素100 mg/L);37 ℃水平培养过夜.③筛选克隆:选取一些独立的转化菌落进行小规模培养,用挑菌环挑取单菌落于4 mL含氨苄青霉素(100 mg/L)的2×YT液体培养基中,于37 ℃、250  r/min 振摇培养过夜.以质粒提取试剂盒从4 mL 菌液提取质粒.④重组体鉴定:以限制性内切酶 EcoRⅠ酶切提取的质粒,琼脂糖凝胶电泳,紫外线凝胶检测仪检测结果.
　　1.3.2       pcDNA3.1(-)/ hURAT1重组体的构建①酶切反应:将pcDNA3.1(-)和酶切鉴定正确的pGEMT Easy Vector/ hURAT1重组体均采用BamHⅠ和EcoRⅠ酶双切,回收pcDNA3.1(-)和hURAT1片段,割胶纯化定量.②连接:采用T4 DNA连接酶将pcDNA3.1(-)片段与hURAT1片段按照摩尔比3~8∶1 于16 ℃下连接过夜.③转化.④筛选克隆.⑤重组体鉴定:首先以限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切提取的质粒进行琼脂糖凝胶电泳,紫外线凝胶检测仪检测结果;其次将酶切鉴定正确的质粒进行测序鉴定(图1).
　　2       结果
　　2.1       目的基因hURAT1的PCR扩增产物
　　以hURAT1基因组DNA为模板,采用设计的上游引物和下游引物通过KOD DNA聚合酶扩增片段,将扩增产物在15 g/L琼脂糖凝胶中进行电泳,片段①可见一条长为1 354 bp的条带,片段②可见一条长为604 bp的条带,最终目的片段是一条长为1 958 bp的条带,所有条带大小均与预期相符,未发现非特异扩增条带.见图2.
　　2.2       重组体的构建及鉴定
　　2.2.1       重组体的酶切鉴定       割胶回收的hURAT1 DNA片段插入载体pcDNA3.1(-),转化DH5α菌株.经氨苄青霉素平板筛选后,选取菌落,摇菌,提取质粒.BamHⅠ与EcoRⅠ双酶切鉴定阳性克隆株结果显示,pcDNA3.1(-)/ hURAT1重组体有长5 203 bp 和 1 949 bp 两条带,证明了重组质粒大小及插入方向是正确的.见图3.
　　2.2.2       重组体的测序鉴定       将重组载体测序鉴定,结果表明插入片段hURAT1基因的序列和方向均正确,符合pcDNA3.1(-)载体的读码框架,证明目的基因已成功转入pcDNA3.1(-)载体中.
　　3       讨  论
　　痛风是一组与遗传有关的由于嘌呤代谢紊乱和(或)尿酸排泄障碍所致的异质性疾病,其临床特点为反复发作的急性关节炎,可表现为痛风石、关节强直或畸形、肾实质损害、尿路结石、高尿酸血症等多种慢性症状.高尿酸血症既是痛风的早期阶段,也是痛风发生、发展的必备条件,阐明原发性高尿酸血症的分子机制对预防和治疗痛风有重要意义.目前研究结果显示,原发性高尿酸血症的发病主要是肾脏对尿酸的排泄减少所致,其中发挥主要作用的是肾小管对尿酸的重吸收增加.在多个近曲肾小管上皮细胞膜上的尿酸转运离子通道中,hURAT1为阴离子交换通道,由12个跨膜结构域组成,该通道通过与乳酸等有机阴离子及氯等无机离子交换,将肾小管管腔内的尿酸等转运入肾小管上皮细胞内.hURAT1是维持血尿酸水平的关键离子通道,其活性异常直接影响血尿酸水平[6].
　　本文PCR扩增hURAT1基因组DNA第2外显子至第5内含子序列后,连接到pcDNA3.1(-)载体中,构建了hURAT1真核表达重组体.该段插入序列中存在SNP位点,其中多个已报道与原发性高尿酸血症和痛风密切相关.GRAESSLER等[3]对389例高尿酸血症病人和263例健康对照者研究显示,hURAT1基因第2外显子C426T多态性与德国人群肾尿酸排泄减少和高尿酸血症显著相关,相对于CC基因型,CT和TT基因型个体肾脏尿酸排泄分数(FEUA)明显降低,血尿酸水平明显升高; J VA'ZQUEZMELLADO等[4]对69例墨西哥原发性痛风病人及其29名一级家属和120名健康个体的hURAT1基因进行序列分析,结果显示,在69例痛风病人中16例存在hURAT1基因突变,占23%,其中 5 种突变位于第5外显子,1 种突变位于第4外显子,16例突变病人中有11例为第5外显子的 C850G 错义突变,提示上述突变可能与原发性痛风有关.尽管hURAT1基因变异与原发性高尿酸血症和痛风的相关性研究取得了较大进展,但仍缺乏功能研究报道,不能说明hURAT1基因突变或SNP是致病位点还是遗传标记,要对其作出因果判断,必须研究hURAT1基因突变或SNP是否影响hURAT1基因表达或蛋白功能.由于hURAT1基因特异表达于人肾小管上皮细胞,体内功能研究较难开展,而本文构建的重组体即可应用定点突变技术特定改变位点碱基,并通过在真核细胞中进一步表达,模拟体内环境,达到研究hURAT1基因变异对尿酸代谢影响机制的目的.
　　此外,本文构建的hURAT1真核表达重组体不但包含基因的编码序列,也包含了其中的内含子序列,从而可用于研究hURAT1基因内含子区基因突变,或SNP以及与内含子特异结合的调控元件对基因转录或翻译的影响机制.作为数倍于外显子的内含子,在生物进化过程中也发挥重要作用,主要参与mRNA剪接、出核孔、转录调控以及翻译过程[7].据相关文献报道,hURAT1基因内含子区也存在与原发性高尿酸血症和痛风病人相关SNP位点,SHIMA等[5]对326例日本人hURAT1 内含子G/T多态(GG,GT和TT)分析表明,男性受试者中不同基因型者血尿酸水平明显不同, GG 基因型者血尿酸水平最高,GT基因型者次之,TT基因型者最低,提出在日本人群中,该SNP位点可作为独立的高尿酸血症预测标记.本文构建的重组体虽然只包含目的基因的部分基因组序列,但插入序列位于pcDNA3.1(-)载体的pCMV启动区域和SV40多聚A尾之间,仍然可以进一步在真核细胞中进行转录表达[8],从而弥补了目前hURAT1体外内含子功能研究的不足.
　　综上所述,本文所构建的hURAT1真核表达重组体经酶切、测序鉴定,证明hURAT1基因组DNA片段插入序列和方向正确,可用于hURAT1基因体外功能研究,尤其是内含子的功能研究,是目前探讨hURAT1异常引起的原发性高尿酸血症和痛风的重要工具.
　　【参考文献】
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　　[8]HIDEKI Y, MASAMITSU N, MIKIYA M, et al. A 5′splice site mutation in the cytochrome P450 steroid 17ahydroxylase gene in 17ahydroxylase deficiency[J]. JCEM, 1997,82,193438.