【摘要】  目的探讨神经调节蛋白1β (NRG1β)对大鼠视网膜缺血再灌注损伤后的保护作用及对Bax表达的影响.方法制备大鼠视网膜缺血再灌注模型.将33只Wistar大鼠随机分为正常组(3只)、对照组(15只)、实验组(15只),于缺血再灌注开始时实验组大鼠玻璃体腔注射5 μL的NRG1β,对照组大鼠玻璃体腔注射平衡盐溶液5 μL.用核苷酸末端转移酶介导的dUTP末端标记法检测视网膜神细胞凋亡的变化,同时利用免疫组化方法检测Bax表达情况的变化.结果凋亡细胞主要出现在视网膜内核层及神经节细胞层,而外核层几乎无阳性表达.与对照组比较,实验组再灌注各时间点视网膜细胞凋亡数目显著减少(t=2.57~6.25,P<0.01),实验组再灌注各时间点Bax蛋白的表达显著降低(t=3.84~11.97,P<0.01).结论 NRG1β对视网膜缺血再灌注损伤具有明显保护作用,NRG1β抑制Bax的表达可能是其抑制视网膜缺血再灌注损伤后细胞凋亡的机制之一.
　　【关键词】  再灌注损伤;视网膜;神经调节蛋白类;bcl2相关X蛋白质
　　[ABSTRACT] Objective To investigate the protection of neuregulin1β (NRG1β) on retinal cells after ischemical reperfusion injury and the effects of NRG1β on the expression of Bax protein. Methods A model of retinal ischemia reperfusion in rat was made. Thirtythree wistar rats were divided into three groups as normal (three rats), control (15 rats) and experimental (15 rats). An injection of 5 μL of NRG1β into vitreous cavity of the rats in experimental group was offered, and 5 μL of BSS in the control group. Retinal paraffin sections were stained with TdTmediated dUTP nick end labeling to examine the apoptosis of retinal cells. The expression of Bax was detected immunohistochemically. Results Apoptotic cells mainly appeared in the inner nuclear and the ganglion cell layers, almost no positive expression was seen in the outer nuclear layer. Compared with the control group, the numbers of apoptotic cells and eressions of Bax in various time points in experimental group were significantly lower(t=2.57-11.97,P<0.01). Conclusion NRG1β shows a significant protection for retina with ischemical reperfusion injury. The inhibition of Bax by NRG1β may be one of the mechanisms preventing the apoptosis of this kind of retinal cell injury.
　　[KEY WORDS] Reperfusion injury; Retina; Neuregulins; Bcl2associated X protein
　　视网膜缺血再灌注损伤(RIRI)是眼科临床上常见病理过程,也是目前缺血性眼病领域的研究热点,其实验动物模型的制备日臻成熟[1],对缺血再灌注损伤机制的研究更全面,基因水平上的研究越来越完备,而最终针对各个可能的损伤机制而采取的保护和治疗措施正逐渐为我们所关注.有研究表明,早期的视网膜缺血再灌注是有益的,经过一定时间,缺血的视网膜并未出现明显功能障碍,但在再灌注后却出现了明显的功能障碍甚至不可逆损伤[2].本研究利用线栓法制作RIRI模型,玻璃体腔注射神经调节蛋白1β(NRG1β)观察视网膜缺血再灌注前后Bax表达的情况,以探讨NRG1β及Bax在RIRI中的作用,为NRG1β对RIRI的治疗提供理论依据.现将结果报告如下.
　　1       材料与方法
　　1.1       动物与分组
　　成年Wistar大鼠33只,雌雄不限,体质量为180~240 g,由青岛市药物检验所动物中心提供.随机分为正常组(3只)、对照组(15只)、实验组(15只).后两组根据灌注时间的不同再分为1、6、12、24、48 h组,所有动物均饲养在正常昼夜环境中.
　　1.2       主要试剂
　　TUNEL凋亡试剂盒、DAB显色试剂盒、SABC 试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司,Bax多克隆抗体和多聚赖氨酸购自北京博奥森生物技术有限公司,NRG1β (纯度>97%)由美国Morehouse School of Medicine公司生产.
　　1.3       动物模型的制备及药物干预方法
　　参照尹晓涛等[3]的方法制备Wistar大鼠RIRI模型.模型制备过程中用氧氟沙星滴眼液(泰利必妥,日本产)滴眼以保持角膜湿润及预防感染,同时保持大鼠肛温在37.0~37.3 ℃.在缺血完毕恢复再灌注初始,分别由左眼耳侧角巩膜缘进入玻璃体腔,实验组注入5 μL的NRG1β,对照组注入5 μL平衡盐溶液,将针头停留约15 s后拔出,以防药液渗漏.
　　1.4       标本采集与处理
　　大鼠分别于再灌注后1、6、12、24、48 h活体取材.摘除眼球后,沿角膜缘切开角膜去除晶状体,随后立即将眼球置于40 g/L的中性甲醛液中固定,时间>24 h.取出组织块行常规脱水、透明、石蜡包埋并切片,片厚 5 μm.
　　1.5       TUNEL及Bax免疫组化染色
　　用TUNEL法检测凋亡神经细胞,检测程序严格按试剂盒操作说明进行;免疫组化法进行Bax染色,DAB显色,苏木精轻度复染,乙醇梯度脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,显微镜下观察并照相.
　　1.6       统计学处理
　　采用SPSS 10.0及PPMS 1.5[4]软件对数据进行处理两样本均数比较采用t检验.
　　2       结 果
　　光学显微镜下观察,细胞胞核中出现棕黄色颗粒为TUNEL染色阳性凋亡细胞.凋亡细胞出现在视网膜内核层(INL)及神经节细胞层(GCL),而外核层(ONL)几乎无阳性表达.正常组未见凋亡细胞,对照组缺血再灌注1 h后仅可见少量凋亡细胞,再灌注后6 h凋亡现象逐渐明显,12 h凋亡细胞数逐渐增多,并于24 h达到高峰,48 h开始下降.实验组再灌注各时间点视网膜神经节细胞凋亡数目较对照组均明显减少(t=2.57~6.25,P<0.01).见表1.正常大鼠视网膜Bax蛋白不表达,Bax蛋白在对照组缺血再灌注1 h有极少量表达,6 h组表达略明显,主要位于GCL,在12 h组表达增强,在24 h组达高峰,以GCL、INL染色最为明显,在48 h组Bax蛋白表达下降.实验组Bax蛋白在各时间点的表达较对照组均减少(t=3.84~11.97,P<0.01).见表2.表1       两组缺血再灌注不同时间点同侧眼神经节细胞凋亡数目比较表2  两组缺血再灌注不同时间点Bax蛋白表达比较
　　3       讨 论
　　视网膜作为神经组织,在缺血低氧环境中极易受损伤,同时,由于视网膜中央动脉是终末动脉,故极易发生缺血,并可迅速导致视网膜的严重损伤.所以,缺血性视网膜损伤在眼科疾病中很常见,原因包括视网膜血管阻塞性疾病、高眼压以及影响视网膜血流量的眼科手术等.视网膜组织在缺血时已发生了功能受损,但恢复血流灌注后并不能使功能障碍减轻,反而加重了组织损伤,具体表现为许多缺血性眼病病人在血液再通后,视网膜损伤更严重,视功能进一步下降.由于能造成永久失明等严重后果,视网膜缺血再灌注损伤已经成为近年来引起广泛关注的眼科课题.在视网膜缺血再灌注损伤中,细胞凋亡是INL和GCL细胞死亡的主要方式.大鼠视网膜缺血再灌注后GCL损伤的主要机制可能与Bax的表达失衡有关.
　　本实验通过线栓法制备大鼠视网膜RIRI模型,在模型制备后,通过对其视网膜形态学上的观察,我们认为该方法制备视网膜RIRI模型行之有效.该方法的特点是:对动物创伤小,手术操作方便,动物存活率高.更为重要的是,和目前最为常用的前房灌注加压法相比,该方法使视网膜免于遭受机械性的压力损伤,其形态学上的变化更有利于我们进行临床研究.但线栓的直径和插入的长度有待进一步的探索,从而不断得到完善.
　　Bax蛋白存在于神经节细胞的胞浆,是一种促凋亡基因.在凋亡诱发因素的刺激下,位于细胞质或松散定位于线粒体膜上的Bax可能通过插入线粒体膜,诱导线粒体蛋白的释放,促进凋亡.
　　NRG是一种由4种基因编码组成的多肽家族,由NRG1基因编码产物经选择性剪接后形成,其中共包括4种异构体--NRG1、NRG2、NRG3、NRG4.NRG1β被认为与神经元的生存和功能有关,DIMAYUGA等[5]研究显示,无论在离体细胞培养还是在体动物模型上,NRG1β对中枢神经系统都具有抗炎作用,从而提示NRG1β可能对缺血性脑损伤具有神经保护作用.缺血诱导的脑损伤和NRG1β的神经保护作用可通过TUNEL染色结果进行评价,大鼠脑缺血再灌注24 h后,在缺血皮质和皮质下区域内的细胞核中可发现强烈的TUNEL染色.而在大鼠脑缺血再灌注前静脉注射NRG1β,能够使皮质缺血半暗带内的TUNEL染色减弱.
　　细胞凋亡的特点是核小体间被活化的核酸内切酶切断,而TUNEL法能使凋亡细胞特异地与断裂DNA的3OH末端结合,并被显示出来,可在组织切片上检出未发生形态改变的早期凋亡细胞,并进行原位定量、定性分析.
　　本研究结果显示,凋亡细胞参与了视网膜缺血再灌注损伤发生,在RIRI过程中视网膜GCL存在着明显的凋亡现象,并以缺血再灌注 24 h组最为显著,而这与国内报道的结果也是吻合的[6].NRG1β处理各时间点视网膜凋亡细胞数目与对照组相比明显减少,差异有统计学意义;实验组各时间点Bax蛋白的表达较对照组均明显下降,差异有统计学意义.说明NRG1β能明显减轻视网膜缺血再灌注引起的视网膜细胞的凋亡,具有明显的视网膜保护作用;而抑制Bax的表达,可能是NRG1β抑制细胞凋亡的机制之一.但NRG1β在视网膜RIRI中发挥保护作用的具体机制有待于作进一步的研究.
　　【参考文献】
　　[1]王景,孟瑞华,尹晓涛,等. 建立猴脑缺血再灌注模型对其视网膜影响[J]. 眼科新进展, 2008,28(4):270273.
　　[2]游志鹏,陈珊,赵菊莲,等. TNFα在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达及NAC对其表达的影响[J]. 眼科新进展, 2006,26(5):351353.
　　[3]尹晓涛,孟瑞华,王景. 线栓法制备大鼠视网膜缺血再灌注模型的初步探讨[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(4):357360.
　　[4]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.
　　[5]DIMAYUGA F O, DING Q, KELLER J N, et al. The neuregulin GGF2 attenuates free radical release from activated microglial cells [J]. J Neuroimmunol, 2003,136(1):6774.
　　[6]李国栋,袁援生,游志鹏,等. 大鼠视网膜缺血再灌注损伤过程中细胞凋亡的变化[J]. 昆明医学院学报, 2006,27(2):7173.