【摘要】  目的 观察姜黄素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3细胞增殖和凋亡的影响.方法 分别用0、10、20、30和40 μmol/L姜黄素作用PC3细胞48 h后,Cell Counting Kit8(CCK8)法检测细胞存活率;选用0、5、10、20 μmol/L姜黄素作用PC3细胞48 h后, Hoechst染色观察PC3细胞形态的变化,Annexin V/PI检测细胞凋亡率.结果 姜黄素能显著抑制PC3细胞的增殖(F=36.82,q=4.88~15.36,P<0.01);除0与5 μmol/L姜黄素组细胞凋亡率比较差异无显著性外,不同浓度姜黄素组之间细胞凋亡率比较差异有显著性(F=7.88,q=4.15~6.54,P<0.05).20 μmol/L 姜黄素作用PC3细胞48 h后,倒置显微镜下可观察到部分凋亡细胞出现染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变.结论 姜黄素能显著抑制体外PC3细胞的增殖,诱导细胞凋亡,为其应用于临床雄激素非依赖性前列腺癌的治疗提供了实验依据.
　　【关键词】  姜黄素;前列腺肿瘤;PC3细胞;细胞凋亡
　　[ABSTRACT] Objective To observe the effect of curcumin on proliferation and apoptosis of PC3 cells in nonandrogendependent prostate cancer.  Methods Different concentrations of curcumin0, 10, 20, 30 and 40 μmol/L were used to act on PC3 cells for 48 h, the survival rate of the cells was then determined using Cell Counting Kit8 (CCK8);  0,5,10, and 20 μmol/L curcumin were used to act on PC3 cells for 48 h and then  the  cell morphology was observed by Hoechst staining. Annexin V/PI was applied for apoptosis detection.  Results Curcumin could significantly inhibit the PC3 cell proliferation (F=36.82,q=4.88-15.36,P<0.01). The differences of the cell apoptosis rates in differentconcentration groups were significant, except for the 0 and 5 μmol/L groups (F=7.88,q=4.15-6.54,P<0.01). After acting with 20 μmol/L curcumin for 48 h, the morphological changes such as chromatic agglutination, karyopyknosis, and  nuclear fragmentation could be seen in part of apoptotic cells with inverted microscope.  Conclusion Curcumin could, in vitro, dramatically inhibit PC3 cell proliferation and induce  apoptosis, which provides an experimental evidence for therapy of nonhormonedependent prostatic cancer.
　　[KEY WORDS] Curcumin; Prostatic neoplasms; PC3 cells; Apoptosis
　　姜黄素是从多年草本植物姜黄中提取的一种酚类色素,它具有消炎、抗氧化、抗动脉粥样硬化和降血脂等作用[1].近年来,随着医学与分子生物学的发展,人们对姜黄素的抗诱变及抗癌作用有了进一步认识[2].姜黄素的抗肿瘤机制是多方面的,其中诱导肿瘤细胞凋亡的机制受到人们广泛的关注.本实验选用雄激素非依赖性前列腺癌细胞株PC3细胞作为研究对象,观察不同浓度的姜黄素对PC3细胞凋亡和增殖的影响,为临床使用姜黄素治疗雄激素非依赖性前列腺癌提供实验依据.现将结果报告如下.
　　1       材料与方法
　　1.1       材料来源
　　人前列腺癌细胞株PC3由上海第二军医大学病理生理教研室卢建教授提供.RPMI 1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司;胰蛋白酶、姜黄素和DMSO为美国Sigma 公司产品;Cell Counting Kit8(CCK8)试剂盒、Hoechst染色试剂盒购自碧云天生物科技有限公司.姜黄素用DMSO 稀释成5×10 μmol/L,过滤除菌后,置于-20 ℃保存,临用前解冻.
　　1.2       实验方法
　　1.2.1       细胞培养       人前列腺癌细胞PC3于含体积分数0.10的胎牛血清、100 kU/L 青霉素、链霉素的RPMI 1640培养液中,在37 ℃含体积分数0.05的CO2培养箱中培养,每2~3 d传代1次.
　　1.2.2       CCK8 法检测细胞生长抑制率       将处于对数生长期的PC3细胞用2.5 g/L的胰蛋白酶消化,使其成为单细胞悬液.血细胞计数板上计数,调整细胞密度为5×108/L,分别以每孔100 μL接种于96孔板,继续培养24 h.细胞贴壁后分别加入姜黄素溶液使终浓度分别为10、20、30、40 μmol/L,以不加药物为对照组,RPMI 1640为阴性对照组,每组设6个复孔.于24 h后,每孔加10 μL的CCK8,设置空白对照孔,CO2孵箱中继续孵育0.5~4.0 h,测450 nm处吸光度(A)计算细胞存活率.肿瘤细胞存活率= (用药组A值/对照组A值)×100%.
　　1.2.3       Hoechst染色观察细胞形态学变化       细胞经消化计数后接种于盛有盖玻片的6孔板,密度为5×107/L,过夜,使盖玻片长满的细胞约为50%~80%.用终浓度为0、5、10、20 μmol/L姜黄素刺激细胞48 h后,吸尽培养液,加入0.5 mL固定液固定10 min.去固定液,用PBS洗2次(用摇床轻轻晃动),每次3 min,吸尽液体.加入Hoechst 33258染色液0.5 mL,染色5 min,轻轻晃动.用PBS洗2次,每次3 min.滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,尽量避免出现气泡.荧光显微镜下观察蓝色细胞核的形态.
　　1.2.4       Annexin V/PI检测细胞凋亡率       选用5、10、20 μmol/L浓度的姜黄素处理PC3细胞,48 h后,将培养瓶内的细胞用4 ℃预冷的PBS洗2次,用250 μL结合缓冲液重新悬浮细胞,调节其密度为1×109/L.将100 μL细胞悬液加入5 mL流式管中,与5 μL的Annexin V/FITC和体积分数0.02碘化丙锭溶液10 mL混合,室温避光孵育15 min,在反应管中加400 μL的PBS,使用流式细胞仪检测细胞凋亡率.
　　1.3       统计学分析
　　应用SPSS 10.0及PPMS 1.5[3]统计软件进行统计学处理,各指标比较采用方差分析,组间比较采用q检验.
　　2       结果
　　2.1       姜黄素作用PC3细胞后体外存活率变化
　　0、10、20、30、40 μmol/L浓度的姜黄素处理细胞48 h后,细胞存活率分别为(97.66±3.12)%、(86.98±3.32)%、(65.84±2.78)%、(53.85±2.74)%、(32.37±3.04)%,不同浓度姜黄素组之间细胞存活率比较差异均有显著性,且呈浓度依赖性 (F=36.82,q=4.879~15.36,P<0.01).
　　2.2       姜黄素对细胞凋亡形态影响
　　经不同浓度的姜黄素作用PC3细胞48 h后,空白对照组的细胞核均匀着色,呈弥散状蓝色荧光,少有异常核(图1a); 10 μmol/L姜黄素组出现少量早期凋亡细胞(图1b);20 μmol/L 姜黄素组细胞出现典型的凋亡形态学变化,镜下可见染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变(图1c).
　　2.3       不同浓度的姜黄素作用PC3细胞后细胞凋亡率的变化
　　选用0、5、10、20 μmol/L的姜黄素处理PC3细胞48 h后,其凋亡率分别为(1.55±4.12)%、(4.94±3.46)%、(8.48±3.78)%、(12.47±3.55)%.除0与5 μmol/L姜黄素组细胞凋亡率没有显著差异外,其他组之间比较差异均有显著性(F=7.88,q=4.15~6.54,P<0.05).
　　3       讨论
　　前列腺癌是欧美国家男性发病率最高的恶性肿瘤,仅2006年估计就有234 460例新诊断病人[4].近年来,随着老龄化社会的进入,我国发病率也显著升高,对男性的健康具有很大的危害.目前对于前列腺癌的治疗,尤其是雄激素非依赖型前列腺癌和前列腺癌发生转移病人仍然缺乏有效治疗手段[5],研究开发新药成为国内外研究热点.姜黄素是从中药姜黄的根茎中提取出来的一种脂溶性酚类色素,自1985年印度学者KUTTAN等[6]报道了姜黄素可以抑制DUHON淋巴瘤细胞以来,姜黄素的抗肿瘤作用日益引起人们的重视.有研究表明,姜黄素可抑制体内、外多种肿瘤细胞的生长,诱导多种细胞株的凋亡,如人类白血病细胞株HL6[7]、人胃癌AGC细胞等[8],其抗癌谱广泛,毒副作用小,是一种具有良好应用前景的天然抗癌新药,美国国立肿瘤研究所更将其列为第三代癌化学预防药.
　　本研究通过不同浓度姜黄素作用于前列腺癌非依赖性PC3细胞,采用CCK8染色法测定细胞存活率,证明姜黄素对癌细胞生长有明显抑制作用,呈剂量依赖性; Hoechst染色显示,经不同浓度的姜黄素作用PC3细胞48 h后, 10 μmol/L姜黄素组出现少量早期凋亡细胞;20 μmol/L 姜黄素组细胞出现典型的凋亡形态,镜下可见染色质凝集、核固缩、核碎裂等形态学改变.用Annexin V/PI检测细胞凋亡率显示,细胞凋亡率呈一定的量效关系.
　　总之,本研究从细胞水平进一步验证了姜黄素的诱导肿瘤细胞凋亡的机制,为姜黄素应用于前列腺癌的治疗提供了实验依据.
　　【参考文献】
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