【摘要】  目的 研究藻蓝蛋白对2型糖尿病大鼠心肌细胞结构及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达的影响,探讨可能的作用机制.方法 健康雄性Wistar大鼠32只,适应性喂养1周后,随机选择8只为正常组(A组),其余24只应用高脂a高糖饲料喂养4周,联合30 mg/kg链脲佐菌素(STZ)腹腔注射方法建立2型糖尿病大鼠模型,造模成功后,将其随机分为模型组(B组)、藻蓝蛋白治疗组(C组)及二甲双胍治疗组(D组),各8只,C、D组分别用藻蓝蛋白及二甲双胍灌胃治疗10 d,生化方法测定各组大鼠空腹血糖,组织病理学技术观察各组大鼠心肌细胞的形态结构,免疫组化技术检测各组大鼠心肌细胞内iNOS的表达.结果 造模成功后,B、C、D组空腹血糖与A组相比明显升高(F=17.54,q=7.73~8.72,P<0.01);治疗后C、D组大鼠空腹血糖较B组明显降低,差异有显著性(F=21.79,q=4.16、7.03,P<0.01); C、D组大鼠心肌细胞的病理形态及结构较B组有较大改善;C、D组大鼠心肌细胞内iNOS阳性细胞数与B组相比明显减少(F=180.30,q=18.88、24.40,P<0.01),而C组与D组大鼠心肌细胞iNOS阳性细胞数比较差异无显著性(P>0.05).结论 藻蓝蛋白可降低糖尿病大鼠空腹血糖水平,改善心肌细胞损伤,并抑制糖尿病大鼠心肌细胞iNOS表达,其作用可能通过抗氧化机制,保护糖尿病状态下的心肌细胞.
　　【关键词】  中国学术期刊网 藻蓝蛋白;糖尿病,2型;一氧化氮合酶;肌细胞,心脏;大鼠,Wistar
　　[ABSTRACT] Objective To investigate the effect of phycocyanin on the cellular structure and the expression of inducible nitic oxide synthase (iNOS) in myocardial cells in rats with type 2 diabetes mellitus. Methods Thirtytwo healthy male Wistar rats were adaptively fed for one week and eight of them were then randomly selected to serve as normal control group (A), the rest were fed with highfat and highglucose forage for four weeks by combination of intraperitoneal injection of (30 mg/kg) streptozotocin (STZ) to create a model of type 2 diabetes in rats. Upon completion of the models, the 24 rats were evenly randomized to diabetesmodel group (B), phycocyanin group (C) and metformin group (D). Intragastric phycocyanin was offered to group C, and metformin to group D, respectively, for 10 days. The fasting blood glucose (FBG) was determined by biochemical assay, the morphosis of cardiac myocytes observed by histopathological technique, and the expression of iNOS within cardiac myocytes detected immunohistochemically. Results After creation of the model, FBG of groups B, C and D was significantly higher than that of group A (F=17.54;q=7.73,8.54, 8.72;P<0.01); Posttherapeutically, the FBG of groups C and D was obviously lower than that of group B (F=21.79;q=4.16,7.03;P<0.01); Morphologically, the cardiac myocytes of rats in groups C and D much improved than those in group B. Compared with group B, the expression of iNOS in groups C and D was weaker (F=180.30;q=18.88,24.40;P<0.01), but the difference of that between the groups C and D was not significant. Conclusion Phycocyanin can lower the FBG, improve the pathologic damage of cardiac myocytes, and inhibit the expression of iNOS in diabetic rats, the action in which might be through antioxidation to protect cardiac myocytes under the status of diabetes.
　　[KEY WORDS] phycocyanin; diabetes mellitus, type 2; nitric oxide synthase; myocytes, cardiac; rats, Wistar
　　机体在正常情况下,一氧化氮(NO)作为一种细胞间及细胞内的信号转导分子,在调节神经、心血管、肺和免疫系统的生理功能中发挥作用.而在致炎因子刺激下,细胞内诱导型一氧化氮合酶(iNOS)迅速表达并产生大量的NO,引起DNA损伤及线粒体呼吸抑制等.此外,多重联级信号被活化,形成炎症联级瀑布反应,促进炎症发展.NO最先是在对血管内皮的研究中发现的,心血管是NO作用的靶器官,越来越多研究表明,心血管疾病包括动脉粥样硬化、心肌缺血、充血性心力衰竭等,都与iNOS表达过量NO紧密相关,而糖尿病伴随的高糖血症、高脂血症、高胰岛素血症可使氧自由基增多、机体氧化能力增强,直接损伤血管内皮细胞[1].藻蓝蛋白作为深海藻类的提取物,安全无毒,其独特的药用作用目前已引起国内外的广泛关注,尤其是其在抗肿瘤等方面的研究已有一定程度的突破,但是其对糖尿病个体的影响迄今鲜有研究.新近研究结果表明,藻蓝蛋白具有抗氧化、抗炎、抗癌、抗辐射及提高机体免疫力等作用[2].本实验旨在通过观察藻蓝蛋白对糖尿病大鼠心肌细胞内iNOS表达的影响,探讨其对2型糖尿病大鼠心肌的保护作用.
　　1 材料与方法
　　1.1 动物来源
　　健康雄性Wistar大鼠32只,鼠龄1个月,体质量130~150 g,由青岛市药检所实验动物中心提供(SCXK(鲁)20030010).实验前置于实验室适应环境1周,自由饮食,室温(23±2)℃,自然光照,相对湿度50%~70%.随机分为正常对照组(A组)8只、模型组24只.A组大鼠喂以普通饲料,其余以高糖高脂饲料饲养[34].
　　1.2 材料与试剂
　　藻蓝蛋白粉剂(藻蓝蛋白由中国科学院海洋研究所提供)暗室分装后-20 ℃保存,用前加蒸馏水稀释至浓度为100 g/L的混悬液.兔抗鼠iNOS亲和纯化抗体、即用型SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均由武汉博士德生物公司提供.
　　1.3 动物模型的建立
　　模型组大鼠饲养4周后禁食12 h,以30 mg/kg剂量一次性腹腔注射100 g/L链脲佐菌素(STZ)柠檬酸缓冲液(以pH 4.2的0.1 mol/L枸橼酸缓冲液配制),A组大鼠同步注射等量柠檬酸缓冲液.模型组注射1周后剪尾取血,测空腹血糖(FBG),以血糖值≥7.0 mmol/L为糖尿病模型建立成功.将24只造模成功大鼠随机分为B、C、D组,每组8只.
　　1.4 干预措施
　　糖尿病大鼠模型造模成功后(实验第9周)开始进行干预治疗.C组按500 mg/kg体质量灌胃给予100 g/L藻蓝蛋白混悬液,每天1次,连续10 d;D组同步给予二甲双胍(400 mg/kg),以蒸馏水稀释至80 g/L浓度连续灌胃10 d;A组和B组同步给予等体积的生理盐水,连续灌胃10 d.
　　1.5 FBG的测定
　　在第1、8及第10周末于大鼠禁食12 h后,次日早鼠尾静脉取血,用血糖仪(强生医疗器材有限公司,稳豪型)测定FBG的水平.
　　1.6 组织病理学观察
　　治疗结束后,引颈处死大鼠,迅速取出心脏,用4 ℃生理盐水冲洗干净,40 g/L甲醛固定24 h,蒸馏水浸泡4 h.常规梯度乙醇溶液脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,LEICA 2135石蜡切片机连续切片,厚度5 μm,裱于涂有多聚赖氨酸的载玻片上,使用苏木精伊红(HE)染色法染色后观察.
　　1.7 免疫组化染色
　　取上述切片常规脱蜡,水化组织切片, 体积分数0.03的过氧化氢溶液室温下作用10 min;蒸馏水洗1 min,共3次;切片置于0.01 mol/L的枸橼酸缓冲液中,微波加热至沸腾,断电15 min,再次加热沸腾后自然冷却;加0.02 mol/L的PBS洗1 min,共3次;加50 g/L的BSA抗原室温下封闭20 min;滴加一抗(1∶100)稀释,37 ℃孵育1 h;0.02 mol/L的PBS 洗2 min,共3次;滴加生物素化二抗,37 ℃孵育20 min;0.02 mol/L的PBS洗2 min,共3次;滴加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素,37 ℃孵育20 min;0.02 mol/L的PBS洗5 min,共4次;DAB显色,镜下控制反应时间;苏木紫复染10 s,自来水冲洗;脱水、透明、中性树脂封片,光镜下观察,特异性染色为片状棕黄色粗颗粒.部分切片不加一抗以0.1 mol/L的PBS替代染色,做阴性对照.光学显微镜(400倍)下,每张切片随机选取4个视野,分别计数每个视野内100个心肌细胞中iNOS的阳性细胞数,以各组的阳性细胞数进行比较.
　　1.8 统计学处理
　　实验数据以SPSS 11.5及PPMS 1.5[5]统计软件包进行处理.
　　2 结 果
　　2.1 一般情况观察
　　第8周B、C、D组大鼠体质量较A组明显降低(F=28.41,q=9.91~11.02,P<0.01).而第10周C组大鼠体质量较B组显著增加(F=49.16,q=2.91,P<0.05),D、B组大鼠体质量比较无明显差异(P>0.05).见表1.
　　2.2 各组FBG比较
　　第8周B、C、D组大鼠空腹血糖与A组比较明显升高(F=17.54,q=7.73、8.54、8.72,P<0.01).第10周C、D组大鼠空腹血糖与B组比较差异有显著性(F=21.79,q=4.16、7.03,P<0.01),C、D组大鼠空腹血糖差异无显著性(P>0.05).见表2.表1 各组大鼠体质量的变化表2 各组大鼠空腹血糖比较
　　2.3 病理形态学观察
　　A组大鼠心肌纤维走行正常,心肌细胞核呈圆形或椭圆形,居细胞中央,间质及微血管结构正常.B组大鼠心肌纤维纵横纹模糊,心肌纤维肥大、断裂、溶解,有颗粒及脂肪变性.C、D组大鼠心肌纤维纵横纹清晰,排列整齐,心肌纤维间质可见少量的纤维细胞增生,心肌纤维轻度肥大.
　　2.4 心肌细胞中iNOS的表达
　　A、B、C、D组心肌组织中iNOS阳性细胞数分别为3.50±2.38、31.00±2.45、14.75±2.50及10.00±1.63, B组大鼠心肌内iNOS阳性细胞数明显高于A组(F=180.30,q=31.96,P<0.01),C、D组大鼠心肌内iNOS阳性细胞数明显低于B组(q=18.88、24.40,P<0.01),但高于A组(q=14.12、8.16,P<0.01).
　　3 讨 论
　　研究表明,STZ诱发的糖尿病大鼠心肌组织中的NO及NOS随着时间的延长和病变的发展逐步升高,心肌组织细胞超微结构的改变也逐步加重[6],提示NOS的异常激活与NO的过度增高参与了糖尿病心肌病变的形成.糖尿病状态下存在心肌肥厚或高灌注状态,心肌局部NO合成增加可能参与了糖尿病心肌肥厚或高灌注的发病机制.另有研究显示,从心肌间密集血管的内皮所释放的NO对心肌细胞有明显的负性肌力作用[7].因此,推论糖尿病心肌病可能与心脏组织中NOS活性上调、NO合成增加有关.
　　BING[8]提出,心肌细胞凋亡是心肌由慢性压力负荷走向衰竭的一种必然结果,而NO是糖尿病心肌病变重要的致病及致细胞凋亡因子.因此,减少NO的过量产生,从根本上抑制细胞凋亡,可以控制心肌细胞衰竭,缓解体内氧化、过氧化和脂质过氧化损伤,改善糖尿病心肌功能.
　　本研究病理结果显示,糖尿病大鼠心肌纤维肥大、断裂、溶解,心肌细胞局灶性颗粒变性、空泡样变,炎细胞浸润,心肌毛细血管官腔狭窄,管壁增厚.而C、D组大鼠心肌病变较轻,心肌毛细血管管壁稍增厚,心肌细胞改善明显,表明C、D组大鼠的糖尿病心肌病变有所缓解.免疫组化结果显示,正常大鼠心肌细胞iNOS表达微弱,B组大鼠心肌内iNOS表达的阳性率明显升高,其结果与其他相关研究结论一致,而C组iNOS表达的阳性细胞数比B组明显降低,佐证了NO所致的损伤作用参与糖尿病性心肌病变的形成.结合二甲双胍已证实的抗氧化作用,说明藻蓝蛋白有抑制iNOS表达,起到抗氧化进而延缓糖尿病心肌病变的作用;同时C、D组血糖值与B组相比有统计学意义,提示藻蓝蛋白可能具有降低血糖,抑制iNOS产生进而保护心肌的作用.
　　总之,本实验结果显示,藻蓝蛋白可降低糖尿病大鼠FBG,改善心肌细胞的病理损伤,并抑制糖尿病大鼠心肌细胞中iNOS表达,其作用可能通过抗氧化机制,保护糖尿病状态下的心肌细胞,该研究为藻蓝蛋白治疗糖尿病及其并发症提供了一定的实验依据,其具体作用机制有待进一步研究.
　　【参考文献】
　　[1]高伟,陈作元,王修卫,等. RAS阻断剂对糖尿病大鼠早期动脉粥样硬化形成影响[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(4):355358.
　　[2]BANISADR F, TEISSIERE F, CURIE I, et al. Antiinfection prophylaxis after sexual assault. Experience of the raymond poincarecarches hospital[J]. Presse Med, 2001,30(6):253258.
　　[3]郭啸华,刘志红,李恒,等. 高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大鼠模型及其肾病特点[J]. 中国糖尿病杂志, 2002,10(5):290294.
　　[4]李爱卿,王志慧,赵跃斌. 高糖高脂饲料诱导2型糖尿病大鼠模型[J]. 临床医学进展, 2005,14(2):130.
　　[5]周晓彬,纪新强,徐莉. 医用统计学软件PPMS 1.5的组成和应用特点[J]. 齐鲁医学杂志, 2009,24(1):2932.
　　[6]MARFELLA R, DI FILIPPO C, ESPOSITO K, et al. Absence of inducible nitric oxide synthase reduces myocardial damage during ischemia reperfusion in streptozotocininduced hyperglycemic mice[J]. Diabetes, 2004,53(2):454462.
　　[7]BRADY A J, WARREN J B, POOLEWILSON P A, et al. Nitric oxide attenuates cardiac myocyte contraction[J]. Am J Physiol, 1993,265(1 Pt 2):H176182.
　　[8]BING O H. Hypothesis: apoptosis may be a mechanism for the transition to heart failure with chronic pressure overload[J]. J Mol Cell Cardiol, 1994,26(8):943948.