【摘要】  目的 观察损毁新生小白鼠弓状核后是否会引起血浆ghrelin水平的变化.方法 取第12周正常对照小鼠和谷氨酸单钠(MSG)处理的小鼠,内眦取血,酶联免疫分析(EIA)法测血浆ghrelin水平;小鼠弓状核冷冻切片,甲酚紫染色观察尼氏体变化;取小鼠胃体黏膜组织,Westen blot检测proghrelin蛋白表达的变化.结果 MSG处理组小鼠下丘脑弓状核尼氏体神经元数量明显少于正常对照组小鼠(t=5.21,P<0.01).两组小鼠血浆ghrelin水平在禁食前后均有明显变化,但两组小鼠之间比较差异无显著性.与禁食前相比,禁食48 h后两组小鼠胃体黏膜组织中proghrelin蛋白表达水平明显升高,但禁食前后两组小鼠之间比较差异无显著性.结论 下丘脑弓状核对MSG处理的小白鼠血浆ghrelin水平的调控并不是必需的.
　　【关键词】  弓状核;ghrelin;小鼠
　　[ABSTRACT] Objective To explore whether the plasma ghrelin level would be changed due to destruction of arcuate nucleus in newborn mice. Methods Orbital blood was taken from 12weekold and monosodium glutamatetreated (MSG) mice. Plasma level of ghrelin was determined with enzymelinked immune assay (EIA), frozen section of arcuate nucleus with cresyl violet staining used for observing changes of Nissl neurons and Western blot employed to study proghrelin protein expression in the mucosa of mouse gastric body. Results The number of Nissel neuron in arcuate nucleus was significantly reduced in MSGtreated mice compared with that of normal controls (t=5.21,P<0.01). There were significant changes of plasma ghrelin level before and after fasting in both groups, but the difference was not statistically different. The level of proghrelin protein expression in gastric mucosa was significantly increased after fasting for 48 h in both groups, but that was not statistically different between the two groups.Conclusion The results suggest that typothalamic arcuate nucleus does not play a critical role in regulating plasma ghrelin levels in MSGtreated mice.
　　[KEY WORDS] arcuate nucleus; ghrelin; mice
　　ghrelin 是由胃黏膜X/A内分泌细胞释放的一种"生长素促分泌素(GHS)",是GHS受体的内源性配体[1].最初观察到ghrelin具有强烈刺激生长素分泌的作用,随后很快发现它可刺激摄食和新陈代谢[2].包括人类在内的多种动物给予ghrelin后均增加其摄食量.ghrelin为迄今惟一的由胃肠道分泌的饥饿激素,是启动摄食的饥饿信号.无论是人还是其他动物,血浆ghrelin都有一个餐前分泌峰[3],而进食后出现一个餐后抑制.另外,许多文献报道新生鼠给予谷氨酸单钠(MSG)处理可选择性地损毁弓状核NPY/ AgRP神经元[4],LUQUET等[5]报道弓状核NPY/ AgRP神经元为成年鼠所必须,而新生鼠弓状核损毁后摄食正常.本研究旨在观察损毁新生小鼠弓状核后是否会引起血浆ghrelin水平的变化.
　　1 材料和方法
　　1.1 动物分组及处理
　　新生健康昆明种小白鼠32只,雌雄不限,由青岛市药检局提供.随机分为正常对照组和MSG处理组,每组16只.MSG处理组小鼠出生后隔日(第1、3、5、7和9天, 共5次)于颈部皮下注射MSG(4 mg/g体质量),而正常对照组只注射同体积的生理盐水.于第4周断乳后,小鼠自由进食、饮水,自然昼夜节律光照.
　　1.2 标本采集
　　12周后,两组小鼠经乙醚麻醉后,分别于禁食前、禁食48 h、进食1 h后内眦各取血0.5 mL,放入已预先加入EDTA(2 g/L)及抑肽酶(5×105U/L)处理的EP管中,4 ℃下3 000 r/min离心15 min,取上清液,于-80 ℃保存.
　　正常对照组和MSG处理组小鼠随机再分为禁食前、禁食48 h组,每组各8只,所有小鼠在规定的时间点采用颈椎脱臼法处死,结扎胃上下两端,速取约50 mg胃体部组织,立即行液氮速冻,24 h后转移至-80 ℃冰箱,以备ghrelin免疫印迹实验.然后小鼠经主动脉灌注,断头取脑组织并以40 g/L多聚甲醛溶液浸泡24 h,分别以200、300 g/L蔗糖作用24 h;液氮速冻,冷冻切片机切片,片厚为20 μm,置于-80 ℃储存备用.
　　1.3 甲酚紫染色
　　切片浸于体积分数1.00氯仿中约30 min,体积分数1.00丙酮中约15 min,体积分数1.00乙醇30 s,体积分数0.95乙醇30 s,体积分数0.70乙醇30 s,超纯水清洗3次;10 g/L焦油紫染色10 min,超纯水清洗3次;体积分数0.70乙醇60 s,体积分数0.95乙醇60 s,体积分数1.00乙醇60 s,体积分数1.00氯仿5 s,分化剂约15 s;体积分数0.95乙醇30 s,体积分数1.00乙醇60 s(共2次),二甲苯5 min(共2次),中性树胶固封.
　　1.4 酶联免疫分析(EIA)法测定血浆ghrelin浓度
　　分别将50 μL标准品、样品、阳性对照加入预先设计好的96孔板孔中,除空白孔外,每孔再分别加入25 μL的兔抗ghrelin一抗和25 μL生物素化肽,室温孵育2 h;每孔加入100 μL SAHRP,室温孵育1 h;每孔加入100 mL TMB作用物溶液,室温孵育1 h;每孔加入2 mmol/L HCl反应终止液100 μL.酶标仪测450 nm处每孔吸光度值,据标准曲线计算样品浓度.
　　1.5 Western blot测定小鼠胃黏膜proghrelin蛋白表达
　　冷冻保存的胃体黏膜组织取出后在三重细胞裂解液中匀浆,4 ℃静置2 h,4 ℃离心(12 000 r/min)10 min,取上清液.用BioRad试剂盒进行蛋白质定量,将蛋白质含量调一致后加上样缓冲液,100 ℃变性5 min,总蛋白上样量为20 μg,于100 g/L的SDSPAGE凝胶中电泳100 min,转至硝酸纤维膜上.用含50 g /L脱脂奶粉的洗脱缓冲液(TBS)封闭后,加入兔抗ghrelin一抗 (1∶5 000,Phoenix Pharmaceuticals, USA)、兔抗βactin一抗 (1∶1 000, 博奥森, 中国) 4 ℃过夜,加入辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗 (1∶10 000, Santa Cruz Biotechnology, USA) 孵育2 h.与ECL显影剂反应,曝光、显影,用扫描仪收集图像,用天能凝胶成像系统照相.proghrelin蛋白表达水平用目的蛋白条带吸光度值与βactin 条带吸光度值之比表示[6].
　　1.6 统计学处理
　　采用SPSS 16.0及PPMS 1.5[7]软件进行统计学分析.实验数据以±s表示,组间比较采用t检验和方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义.
　　2 结 果
　　2.1 甲酚紫染色
　　MSG处理组小鼠下丘脑弓状核切片平均吸光度值(0.24±0.09)明显低于正常对照组的(0.83±0.11),差异有显著性(t=5.21,P<0.01).
　　2.2 各组小鼠血浆ghrelin水平比较
　　MSG处理组小鼠在禁食48 h后血浆ghrelin水平也明显高于禁食前,进食后血浆ghrelin水平又明显降低(F=5.031,P<0.01);正常对照组小鼠在禁食48 h后血浆ghrelin水平明显高于禁食前,进食后血浆ghrelin水平又明显降低(F=2.650,P<0.05).MSG处理组与正常对照组小鼠比较,无论是在禁食前、禁食48 h,还是进食后,血浆ghrelin水平差异均无显著性.见表1.
　　2.3 各组小鼠胃黏膜proghrelin水平比较
　　MSG处理组及正常对照组小鼠禁食48 h后胃黏膜组织proghrelin 蛋白表达分别为1.41±0.12、1.32±0.14,禁食前分别为0.82±0.09、0.71±0.09,两组小鼠在禁食48 h后胃黏膜组织proghrelin 蛋白表达均明显高于禁食前(t=4.39、3.54,P<0.01).而两组小鼠之间相比较,在禁食前、后胃黏膜组织proghrelin 蛋白表达水平差异均无显著性.见图1. 表1 禁食前后两组小鼠血浆ghrelin水平
　　3 讨 论
　　相比较而言,进食对血浆ghrelin餐后抑制研究比较详尽,认为其餐后抑制可能是摄入营养物质后所产生饱感效应的机制之一,此餐后抑制和饱感信号CCK有协同作用,从而终止进食.三大营养物质,以葡萄糖引起餐后抑制最强,而以脂肪最弱.进一步研究表明,并非营养物质入胃或胃扩张,而是营养物质进入十二指肠或小肠介导此餐后抑制[8].
　　关于迷走神经对ghrelin分泌的调节作用,最近的研究表明,膈下切断双侧迷走神经并不影响ghrelin的基础分泌及其餐后抑制,但禁食诱发的餐前分泌峰则不复存在,阿托品可减弱餐前分泌峰,提示饥饿通过增强迷走神经传出性紧张活动刺激ghrelin释放[9].HOSODA等[10]于2007年观察到胆碱能和肾上腺素能神经参与ghrelin分泌的调控,胆碱能受体激动剂、肾上腺素能α受体阻断剂和肾上腺素能β受体激动剂促进ghrelin分泌,胆碱能受体阻断剂、肾上腺素能α受体激动剂抑制ghrelin分泌.如上所述,胆碱能神经在调控胃肠道、胰腺的内分泌功能中起重要作用,中枢神经系统通过胆碱能神经介导ghrelin餐前分泌峰.但是,迄今为止,介导ghrelin餐前分泌峰的中枢神经通路仍不清楚.只有TSCHP等[11]报道切除垂体使血浆ghrelin水平显著升高.
　　本文旨在观察新生小鼠皮下注射MSG导致下丘脑弓状核大部分神经元受到破坏后,是否使血浆ghrelin水平发生改变.结果显示,无论是MSG处理的小白鼠,还是正常对照小白鼠,禁食48 h后,血浆ghrelin水平依旧比基础水平升高明显,餐前分泌峰依旧存在;再进食后血浆ghrelin水平又明显降低.且两组小白鼠胃黏膜ghrelin前体蛋白proghrelin在禁食前后亦有明显变化,说明血浆ghrelin水平的变化是由胃黏膜ghrelin水平的变化引起的.
　　综上所述, 小白鼠下丘脑弓状核损毁后对血浆ghrelin水平的变化影响不大,从而说明其并不是必须的.中枢参与血浆ghrelin水平的调控可能更依赖于其他核团的参与,需要进一步研究.
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