【摘要】  目的 研究西松烷型二萜对小鼠H22肝癌腹水瘤抑制作用,并初步探讨其作用机制.方法 建立昆明小鼠H22肝癌腹水瘤模型,随机分为生理盐水组(Ⅰ组)、西松烷型二萜低剂量组(Ⅱ组)、中剂量组(Ⅲ组)、高剂量组(Ⅳ组)与环磷酰胺组(Ⅴ组).建模后24 h开始给药,Ⅱ~Ⅳ组以不同剂量的西松烷型二萜连续灌胃给药7 d,对照组给予同体积生理盐水,Ⅴ组连续腹腔注射环磷酰胺7 d,末次给药24 h后处死半数动物.计算平均腹水量、腹水抑制率、腹水中瘤细胞数、瘤细胞存活率、细胞因子白细胞介素2(IL2)、干扰素γ(IFNγ)浓度.另一半小鼠继续观察生存状况,计算生存期及生存延长率.结果 Ⅲ、Ⅳ组腹水量与Ⅰ组比较明显减少(F=28.37,q=2.91、4.76,P<0.05),腹水抑制率随药物剂量增加而升高.Ⅱ~Ⅳ组瘤细胞计数及瘤细胞存活率与Ⅰ组比较显著降低(F=7.21-19.13,q=2.92~4.76,P<0.05).Ⅱ~Ⅳ组小鼠平均生存期与Ⅰ组比较显著延长(F=35.77,q=2.91~4.75,P<0.05),延长率分别为20.21%、42.10%和51.02%.与Ⅴ组比较,Ⅱ、Ⅲ组小鼠在饮食、活动等方面状态较好.Ⅳ组用药期间食欲下降,活动少,停药后好转.Ⅱ~Ⅳ组IL2和IFNγ含量与Ⅰ组比较,差异均有显著性(F=21.17、35.47,q=2.93~4.77,P<0.05).结论 西松烷型二萜对H22肝癌腹水瘤的生长具有明显的抑制作用,其机制可能与影响细胞免疫功能有关,其有可能开发成为一种新的海洋源性抗肿瘤药物.
　　【关键词】  西松烷型二萜;H22肝癌腹水瘤;抑制作用;细胞因子;小鼠
　　[ABSTRACT] Objective To study the inhibitory action and mechanism of cembranetype diterpenes (CTD) collected in ceriops tagal on mice bearing H22 ascitic tumor. Methods A model of ascitic tumor in mice with hepatoma22 (H22) was created. All the models were randomized to five groups: group 1, normal saline group; group 2, lowdose CTD (5 mg/kg); group 3, middledose CTD (10 mg/kg); group 4, highdose CTD (20 mg/kg); group 5, cyclophosphamide (CTX 10 mg/kg). Medication started at 24 hours after the models were created. Different doses of CTD were lavaged for mice in groups 2, 3 and 4 for seven days, those in group 1 were given normal saline, and those in group 5, intraperitoneal CTX was administered for seven days. Half of the mice of each group were killed 24 hours after the last medication. The average volume of ascites, inhibition rate of ascites, tumor cell number and the cell survival rate, the levels of cytokine interleukin 2 (IL2) and interferonγ (IFNγ) in ascites were detected. The other half of the mice were continuely followed up for their living condition and life span. Results Compared with group 1, the volume of ascites in groups 3 and 4 reduced obviously (F=28.37;q=2.92,4.76;P<0.05), the inhibition rate of ascites increased with the increase of the dose of CTD. The number of tumor cells and survival rate in groups 2, 3 and 4 were less than that in group 1 (F=7.21-19.13;q=2.41-4.75;P<0.05). The mean survival duration of mice in groups 2,3 and 4 was longer than that in group 1, the extension rate was 20.21%, 42.10% and 51.02%, respectively (F=35.77;q=2.91-4.76;P<0.05). In comparison with group 5, those in groups 2 and 4 were better in terms of the condition of eating, drinking, and activities. The appetide of mice in group 4 was poor and less activities during medication, but improved after drug withdrawal. The differences of levels of cytokine IL2 and IFNγ in ascites between groups 2, 3, and 4 were significant (F=21.17,35.47;q=2.93-4.77;P<0.05). Conclusion The cembranetype diterpenes has a significant inhibitory effect on mice brearing H22 ascitic tumor. Its mechanism may be associated with cellular immunity, which is likely to be a potential in the development of a novel marine antitumor drug.
　　[KEY WORDS] cembranetype diterpenes; mouse ascitic tumor model with Hepatoma22; inhibitory effect on tumor; cytokine; mouse
　　海洋中蕴含着大量的天然活性物质,这为新药研制提供了重要的先导化合物,是创新药物的丰富源泉.其中海洋生物活性物质抗肿瘤研究进展很快,是海洋药物开发的重要方向.近年来,随着深海生物采集、海洋生物大规模人工养殖、色谱分析分离、基因工程等新兴技术的采用,使海洋抗肿瘤活性物质的生物资源开发进入了黄金时期.研究的热点主要集中在含氮类化合物,主要包括多肽和生物碱类、大环内酯类、萜类及其他多种化合物.研究显示萜类化合物具有显著的细胞毒和抗肿瘤活性[16].西松烷型二萜是萜类化合物的一族,本课题组前期研究已证实了西松烷型二萜成分的体外抗肿瘤作用并通过了体外抗肿瘤活性筛选[7],目前尚无该化合物关于动物体内实验研究的相关报道.本文用北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室自海洋红树植物角果木中分离纯化的西松烷型二萜,通过对小鼠H22肝癌腹水瘤模型用药后腹水量、瘤细胞密度、瘤细胞存活率、部分细胞因子变化的研究,探讨其对H22腹水瘤的抑制作用及初步机制.
　　1 材料与方法
　　1.1 材料
　　西松烷型二萜溶液由"863海洋动植物来源创新候选药物研究课题组"提供.规格:20 g/L,我院肿瘤科实验室负责稀释与分装,样品储存于青岛大学医学院附属医院脑科研究所.细胞因子试剂盒购自北京晶美生物工程有限公司.其他主要试剂均购自美国Gibco公司.瘤株与实验动物H22小鼠肝癌细胞株由中国海洋大学提供.昆明种小鼠80只,雌雄各半,4~6周龄,体质量18~21 g,由青岛市药品食品监督管理局实验动物中心提供.
　　1.2 方法
　　1.2.1 细胞培养与腹水瘤模型的建立 解冻小鼠H22肝癌细胞株,离心,弃上清.加入生理盐水将细胞密度调至1×1010/L.取0.5 mL细胞悬液(含5×106个细胞)接种于小鼠腹腔内.待小鼠出现腹水后(接种第7天),断颈处死小鼠,无菌条件下抽取腹水,放入离心管中,以1 000 r/min离心5 min,弃上清,加入生理盐水吹洗,再离心,共2次.再用生理盐水稀释肿瘤细胞悬液,调节细胞密度为2.0×1010/L.锥虫蓝染色镜检细胞存活率≥95%.记录每只昆明种实验小鼠体质量后,用体积分数0.70乙醇腹部消毒,每只小鼠腹腔注入H22腹水瘤细胞悬液0.2 mL(含癌细胞4×106个),共接种小鼠腹腔80只,制作成腹水瘤动物模型.实验小鼠均在第7天见到腹部膨隆,小鼠腹水瘤模型制作成功.
　　1.2.2 实验分组及给药 建模次日,随机分为生理盐水组(Ⅰ组)、 5 mg/kg西松烷型二萜低剂量组(Ⅱ组)、10 mg/kg西松烷型二萜中剂量组(Ⅲ组)、20 mg/kg西松烷型二萜高剂量组(Ⅳ组)、10 mg/kg环磷酰胺组(Ⅴ组),每组16只.分组当日开始灌胃给药.Ⅱ~Ⅳ组分别给予西松烷型二萜5、10、20 mg/kg,Ⅰ组给予等体积生理盐水,Ⅴ组给予腹腔注射环磷酰胺(CTX)10 mg/kg,均连续给药7 d,每天1次.
　　1.2.3 观察指标 末次用药后24 h处死各组半数小鼠.在无菌条件下用注射器采集腹水计量腹水体积,计算腹水抑制率.腹水抑制率=(生理盐水对照组平均腹水量-其他各组小鼠平均腹水量)/生理盐水对照组平均腹水量×100%.每只取0.5 mL计数瘤细胞密度,锥虫蓝染色后镜检计瘤细胞存活率.余腹水继续检测细胞因子白细胞介素2(IL2)、干扰素γ(IFNγ)的含量.其余小鼠继续观察饮食、活动等一般情况及生存时间,计算各组小鼠的平均生存期,以及相对于Ⅰ组的生命延长率.计数天数自腹水瘤模型制作成功算起.生命延长率(%)=(其他各组小鼠平均生存时间-Ⅰ组小鼠平均生存时间)/Ⅰ组小鼠平均生存时间×100%.
　　1.2.4 细胞因子测定 采用双抗夹心ELISA法,严格按照试剂盒说明书进行操作.
　　1.2.5 统计学方法 应用SPSS 15.0 for Windows统计软件包进行统计分析.数据用±s表示, 组间比较采用NSK检验.
　　2 结 果
　　2.1 西松烷型二萜对小鼠H22肝癌腹水瘤的抑制作用
　　Ⅲ、Ⅳ组小鼠腹水量与Ⅰ组比较明显减少(F=28.37,q=2.92、4.76,P<0.05),Ⅱ组与Ⅰ组比较变化不明显(P>0.05);Ⅱ~Ⅴ组腹水抑制率分别为10.20%、50.20%、77.55%和93.37%.随用药剂量加大,瘤细胞数及瘤细胞存活率渐趋减少或下降,Ⅱ~Ⅳ组与Ⅰ组相比较差异均有显著意义(F=7.21、19.13;q=2.91~4.76;P<0.05).见表1.
　　2.2 西松烷型二萜对荷瘤小鼠生存时间的影响
　　Ⅱ~Ⅴ组小鼠随用药剂量加大其平均生存时间逐渐延长,与Ⅰ组比较,差异均有统计学意义(F=35.77,q=2.91~4.75,P<0.05),但Ⅲ、Ⅳ组组间比较差异无统计学意义(P>0.05),Ⅱ~Ⅳ组小鼠生命延长率分别为20.21%、42.10%和45.98%.
　　见表2.
　　2.3 西松烷型二萜对H22肝癌腹水瘤小鼠生活质量影响
　　用药期间Ⅴ组有2只小鼠出现呕吐,食欲差,便稀,其余不同程度地出现皮毛蓬乱,少量脱毛,懒动,明显消瘦,停药后渐好转.Ⅱ、Ⅲ组多数小鼠用药过程饮食增加,无呕吐腹泻,皮毛光滑,无脱毛,运动活跃,腹部鼓胀减慢.Ⅳ组小鼠用药7次后均出现体质量下降,消瘦,腹部鼓胀减轻,进食稳定,运动正常,无呕吐腹泻,无脱毛.用药各组小鼠均无死亡.
　　2.4 西松烷型二萜对腹水中细胞因子IL2、IFNγ浓度的影响
　　Ⅱ~Ⅳ组腹水中IL2与IFNγ含量与Ⅰ组比较,差异均有显著性(F=21.17、35.47,q=2.93~4.77,P<0.05).见表3表1 西松烷型二萜对H22肝癌腹水瘤腹水及瘤细胞抑制作用表2 西松烷型二萜对H22肝癌腹水瘤小鼠生存的影响表3 西松烷型二萜对小鼠腹水中IL2,IFNγ浓度的影响
　　3 讨 论
　　西松烷型二萜属于十四元大环二萜,最早于1951年自植物Pine oleresins和烟草中分离得到.1960年代以来,相继从海洋生物中分离得到了一系列西松烷型二萜类化合物,至1997年已鉴定的这类结构化合物达300种左右[8].这类化合物结构变化多样, 广泛分布于海洋动植物中.目前所纯化的大多数西松烷型二萜都具有较好的细胞毒和抗肿瘤活性[46].目前关于该类物质抗肿瘤作用的研究多处于体外实验研究水平,动物移植瘤体内抗肿瘤作用的研究鲜有报道.本实验以从中国海洋红树植物角果木的次生代谢成分分离纯化的西松烷型二萜为实验用药品,探讨其对小鼠H22肝癌腹水瘤模型的作用.结果显示,西松烷型二萜可使小鼠H22腹水瘤模型腹水量、腹水瘤细胞密度或瘤细胞存活率明显下降,生存期明显著延长,证实该药能有效地控制癌性腹水,抑制腹水瘤细胞的增殖,减低瘤负荷.本文结果同时显示,应用西松烷型二萜能明显改善小鼠的生存状况,提高生活质量.井小会等[9]曾利用以上指标观察人参皂甙Rg3对小鼠H22肝癌腹水瘤作用,结果显示,不同用药组在腹水量、腹水中瘤细胞数和瘤细胞存活率方面都随着给药浓度的增加而显著下降(P<0.05),各实验用药组较生理盐水组小鼠寿命延长,从而得出人参皂甙Rg3对小鼠恶性腹腔积液的形成具有抑制作用的肯定结论,其与本实验结果相一致.胡迎芬等[10]利用以上指标及方法观察冬枣提取物对荷瘤小鼠的免疫及抗氧化作用,得到肯定结论.金鹏飞等[6]以自中国南海软珊瑚中提纯的不同结构的西松烷型二萜分别对白血病细胞、肝癌细胞、肺癌细胞等6种肿瘤细胞进行体外抑瘤实验,结果显示,抑制率一般在50%~80%之间,与本实验的Ⅲ、Ⅳ组实验结果大体一致,这进一步证实了西松烷型二萜具有细胞毒活性.
　　同时本实验利用小鼠腹水瘤模型,测定了小鼠腹水中细胞因子IL2与IFNγ浓度,结果表明,Ⅱ~Ⅳ组腹水中IL2与IFNγ含量与Ⅰ组比较差异均有显著性(P<0.05),而且随药物剂量增加表现出升高趋势.机体内介导细胞免疫的主要有T 细胞、NK细胞及单核巨噬细胞等,IL2即是一种主要由辅助性T淋巴细胞分泌的淋巴因子,它能激活NK、LAK等多种免疫细胞,激活淋巴细胞的吞噬活性,促进IL6和TNFα等多种细胞因子的产生,是机体最主要、最强有力的T细胞生长因子[11].IFNγ由细胞毒性T细胞和辅助T细胞的Th1亚群产生, 当抗原刺激机体后, T细胞分泌的IFNγ能促进CTL、B细胞成熟及分化,产生抗体及Ig类型转换,激活中性粒细胞功能和NK细胞杀伤活性,激活血管内皮细胞等,对多种肿瘤有良好疗效,是细胞免疫功能的检测指标之一[12].此外,IFNγ还能协同诱导肿瘤细胞凋亡[13].本研究结果显示,西松烷型二萜用药后可以诱导IL2、IFNγ的产生,提示西松烷型二萜抗肿瘤机制可能与升高机体细胞因子水平有关.
　　综上所述,西松烷型二萜对小鼠H22腹水瘤具有明显的抑制作用,能延长其生存期,提高生活质量,其作用机制不排除与细胞免疫有关.该类化合物作为一种海洋动植物来源创新候选药物,有希望开发成一种有前途的抗肿瘤新药.由于本实验为对西松烷型二萜抗瘤活性的初步探讨,采用样本小,观测指标少,其全面作用及机制有待今后大样本、设计更合理完善的实验进行研究.
　　【参考文献】
　　[1]SHERLY A P.The bioprocesstechnological potential of the sea[J]. Biotechnology, 1999,70(1):513.
　　[2]DUH C Y, WANG S K, TESING H K. Novel cytotoxic cembranoids from the soft coral Sinularia flexibilis[J]. J Nat Prod, 1998,61(6):844847.
　　[3]LIN C W, SU J Y. A study survey of chemical constituents and biological activities of marine soft coral Sinularia[J]. Tropic Oceanology, 2001,20(4):8793.
　　[4]黄建设,龙丽娟,张恩. 海洋天然产物及生理活性研究进展[J]. 海洋通报, 2001,20(4):8391.
　　[5]欧阳高亮,李祺福,田长海. 海洋生物抗肿瘤活性物质及其作用机理研究进展[J]. 海洋科学, 2003,27(7):2124.
　　[6]金鹏飞,林文翰,邓志威. 中国南海软珊瑚Sinularia dissecta的化学成分研究[J]. 中国药物化学杂志, 2007,17(2):95100.
　　[7]温烃,邓志威,林文翰. 中国南海软珊瑚Sinularia flexibilis中西松烷型二萜的研究[J]. 中国药学杂志, 2008,43(07):493496.
　　[8]李国强,张艳玲,林文翰. 西松烷二萜类海洋活性成分研究进展[J]. 中国海洋大学学报, 2006,36(3):370376.
　　[9]井小会,张灿珍,王羽丰. 人参皂甙Rg3对小鼠肝癌H22腹水瘤的治疗研究[J]. 临床肿瘤学杂志, 2007,12(7):522525.
　　[10]胡迎芬,马莉,马爱国,等. 冬枣提取物对S180荷瘤小鼠的免疫及抗氧化作用[J]. 青岛大学医学院学报, 2009,45(4):343346.
　　[11]AMININ D L, PINEGIN V, PIHUGINA L V, et al. Immunomodulatory properties of Cumaside[J]. Int Immunol, 2006,6(7):10701082.
　　[12]巩国亭,管洪在. 细胞因子IL12、IFNγ与恶性血液病的关系[J]. 齐鲁医学杂志, 2008,23(2):184186.
　　[13]MORISAKI T, MATSUNAGA H, BEPPU K, et al. A combination of cyclosporinA (CsA) and interferongamma (INFgamma) induces apoptosis in human gastric carcinoma cells[J]. Anticancer Res, 2000,20(5B):33633373.