【摘要】  目的 研究端粒酶和细胞角蛋白19片段(CYFRA 211)测定对鉴别良、恶性胸腔积液的价值.方法采用端粒重复序列扩增酶联免疫吸附实验法(TRAPPCRELISA)和酶免疫分析法(EIA),分别测定80例恶性胸腔积液和50例良性胸腔积液中的端粒酶活性和CYFRA 211水平.结果 胸腔积液中端粒酶活性和CYFRA 211的阳性率在恶性胸腔积液组分别为77.5%(62/80)和60.0%(48/80),在良性胸腔积液组分别为6.0%(3/50)和22.0%(11/50),两组比较差异有显著性(χ2=62.921、17.925,P均<0.001).端粒酶活性测定诊断恶性胸腔积液的灵敏度为77.5%(62/80),特异度为94.0%(47/50);CYFRA 211诊断的灵敏度60.0% (48/80),特异度78.0%(39/50),两组比较差异有显著性(χ2=4.103、5.316,P<0.05).两者联合检测的灵敏度为90.0%(72/80),特异度为82.0%(41/50),联合检测的灵敏度高于端粒酶和CYFRA 211单项检测(χ2=4.592、19.201,P<0.05、0.001).结论 端粒酶和CYFRA 211测定对鉴别良恶性胸腔积液均有一定的价值,其中端粒酶测定的灵敏度和特异度较CYFRA 211高,两者联合测定可提高诊断准确率.
　　【关键词】  端粒酶;CYFRA 211;胸腔积液;诊断,鉴别
　　[ABSTRACT] Objective To study the value of telomerase activity (TA) and the level of CYFRA 211 in differential diagnosis between benign and malignant pleural effusion. Methods TA and level of CYFRA 211 were respectively examined by means of telomeric repeat amplification protocolPCRELISA (TRAPPCRELISA) and EIA from 80 specimens of malignant pleural effusion and 50 benign pleural effusion. Results The positive rates of TA and CYFRA 211 were 77.5% (62/80) and 60.0% (48/80), respectively, in specimens of malignant pleural effusion; and 6.0% (3/50) and 22.0% (11/50) in benign one, the differences between them were significant (χ2=62.921,17.925;P<0.001). Sensitivity of TA in the diagnosis of malignant effusion was77.5% (62/80), specificity was 94% (47/50), while that of CYFRA 211 level was 60.0% (48/80) and 78% (39/50), the differences between them were also significant (χ2=4.103,5.316;P<0.05). However, the sensitivity of the combined testing was90.0% (72/80) and the specificity was 82.0% (41/50), which were higher than either of telomerase or CYFRA 211 testing alone (χ2=4.592,19.201;P<0.05,0.001). Conclusion Detection of the TA and CYFRA 211 in pleural effusion is of a definite value in differentiating benign from malignant pleural effusion, and the detection of TA is more sensitive and specific than detection of CYFRA 211. Combined detection of both markers may raise the accuracy of the diagnosis.
　　[KEY WORDS] telomerase; CYFRA 211; pleural effusion; diagnosis, differential
　　胸腔积液是临床常见症状之一,近年研究表明,端粒酶和细胞角蛋白19片段(CYFRA 211)在恶性胸腔积液中呈阳性表达,可用于恶性胸腔积液的鉴别诊断[1].但单个肿瘤标志物的检测存在灵敏度和特异度均较低的问题,临床上有20%~30%的病人用常规方法不能明确胸腔积液的性质.本文采用端粒重复序列扩增酶联免疫吸附实验法(TRAPPCRELISA)和酶免疫分析法(EIA),分别测定了80例恶性胸腔积液和50例良性胸腔积液病人胸腔积液中端粒酶活性和CYFRA 211水平,探讨此两项肿瘤标志物联合检测在良恶性胸腔积液中的鉴别诊断价值,现将结果报告如下.
　　1 资料与方法
　　1.1 一般资料
　　恶性胸腔积液病人80例,男50例,女30例,年龄49~76岁,平均(59.5±9.7)岁;均有确切的病理组织学或细胞学诊断依据, 其中鳞癌39例,腺癌21例,小细胞癌15例,大细胞癌5例.良性胸腔积液病人50例,男32例,女18例,年龄47~73岁,平均(57.5±8.1)岁;均依据临床表现、结核菌素试验、胸腔积液常规生化及细菌培养等检查确诊,其中结核性胸膜炎25例,肺炎18例,支气管扩张5例,肺脓肿2例.
　　1.2 端粒酶活性测定方法
　　常规行胸腔穿刺术抽取新鲜胸腔积液100 mL,离心(4 ℃,1 200 r/min,10 min),弃上清,离心细胞置液氮中保存(-196 ℃).检测前用预冷的PBS缓冲液(pH 7.4)漂洗细胞2次,离心(4 ℃,1 200 r/min,10 min),弃上清.然后,加预冷的端粒酶裂解缓冲液,0 ℃孵化30 min,离心(4 ℃,12 000 r/min,20 min),吸出上清液,取少许测定蛋白浓度,将细胞提取物稀释至3 g/L.采用TRAPELISA法,将上述标本的沉淀细胞(约105~106个)置于1.5 mL离心管,150 μL裂解液抽提端粒酶.端粒酶活性测定按试剂盒说明进行.扩增产物经包被好的微量96孔板捕获后,加辣根过氧化物酶标记的抗二硝基苯抗体(AntiDNP)孵育1 h后洗涤,用四甲基联苯胺(TMB)显色10 min.MK3酶标仪(Dragon Lab System公司)上用双波长法测定各孔波长450 nm处吸光度(A450)、波长690 nm吸光度(A690)的值,以A690为参考波长,用于消除孔间误差.端粒酶活性△A= A450-A690.△A大于阴性对照孔的2.0倍即判定为端粒酶阳性.灵敏度=恶性胸腔积液病人中阳性例数/恶性胸腔积液病人总数.
　　1.3 CYFRA 211 测定
　　取胸腔积液5 mL,采用EIA法测定CYFRA 211.试剂盒由德国Boehringer Mannheim公司提供,严格按试剂盒说明书要求操作.阳性判断标准为 CYFRA 211>10 μg/L.
　　1.4 统计学处理
　　采用SPSS 12.0及PPMS 1.5[2]统计学软件进行数据处理,数据间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义.
　　2 结 果
　　2.1 良恶性胸腔积液中端粒酶活性和CYFRA 211水平的比较
　　胸腔积液中端粒酶和CYFRA 211的阳性率在恶性胸腔积液组分别为77.5%(62/80)和60.0%(48/80),在良性胸腔积液组分别为6.0%(3/50)和22.0%(11/50),恶性胸腔积液组端粒酶和CYFRA 211的阳性率均明显高于良性胸腔积液组,差异有显著性(χ2=62.921、17.925, P<0.001).见表1.
　　2.2 端粒酶和CYFRA 211单项及联合检测对恶性胸腔积液的诊断价值
　　端粒酶活性测定对恶性胸腔积液诊断的灵敏度和特异度均较CYFRA 211高,差异有显著意义(χ2=4.103、5.316,P<0.05).两项肿瘤标记物联合检测若以其中一项阳性作为恶性胸腔积液的诊断标准,则联合检测灵敏度为90.0%(72/80),明显高于端粒酶和CYFRA 211单项检测的灵敏度71.3%和60.0%,差异均有显著意义(χ2=4.592、19.201,P<0.05、0.001).见表2.表1 良恶性胸腔积液端粒酶和CYFRA 211的表达比较表2 端粒酶和CYFRA 211检测对恶性胸腔积液的诊断价值
　　3 讨 论
　　端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白酶,是一种特殊的逆转录酶,它能催化染色体末端的特殊结构端粒复制,存在于人的生殖细胞、永生化细胞系、肿瘤细胞和增殖组织.恶性肿瘤细胞的一个重要生物学特征是永生化,这与端粒酶激活有关.且端粒酶活性的表达与肿瘤的发生、发展都有相关性.众多研究显示,虽然端粒酶的活性不是引起细胞癌变的初始因素,但却是一个维持肿瘤生长的继发性改变,85%的人类肿瘤组织有端粒酶表达,而与肿瘤相邻的正常组织或良性病变仅有4%表达,且表达水平较低[3].姚珂等[4]研究表明,在恶性胸腔积液中端粒酶阳性率可达47.5%~90.4%,胸腔积液细胞端粒酶活性测定的灵敏度为91.4%,特异度为95.3%.
　　CYFRA 21l由多种上皮细胞表达,是一种相对分子质量为40 000~68 000的细胞结构蛋白,主要分布于肺组织尤其是肺肿瘤上皮细胞浆中,可在激活的蛋白酶作用下被降解或在细胞死亡后以溶解片段形式释放入血清中[5].已有研究结果表明,恶性胸腔积液病人血和胸腔积液中CYFRA 211水平均明显增高,且以胸腔积液中升高明显,其对恶性胸腔积液诊断灵敏度约50%~77%,特异度约60%~79%[6].
　　本文测定了80例恶性胸腔积液病人和50例良性胸腔积液病人胸腔积液中端粒酶和CYFRA 211的水平,检测结果显示,恶性胸腔积液中端粒酶和YFRA 211表达的阳性率明显高于良性胸腔积液,与相关文献的报道一致[7].提示端粒酶和CYFRA 211测定均可作为良恶性胸腔积液鉴别诊断的辅助手段.
　　本文结果还显示,端粒酶测定用于诊断恶性胸腔积液的灵敏度和特异度分别为71.3%和86.0%,均高于CYFRA 21l诊断的灵敏度(60.0%)和特异度(78.0%).若将端粒酶和CYFRA 211两项肿瘤标志物联合检测,以其中一项阳性作为恶性胸腔积液的诊断标准,则灵敏度为90.0%(72/80),但特异度为82.0%(41/50);若以两项均阳性作为诊断标准,灵敏度虽下降至56.3%(45/80),但特异度可达94.0%(47/50).故采用端粒酶和CYFRA 211两项肿瘤标志物联合检测可提高诊断效能,弥补单项标志物检测对不同组织类型肿瘤敏感性不同的缺点,可提高恶性胸腔积液的诊断率,尤其对良恶性胸腔积液的鉴别诊断具有重要的意义.
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