乙型脑炎病毒C蛋白编码基因重组质粒构建与表达
　　【摘 要】 目的 构建流行性乙型脑炎病毒(JEV)C蛋白编码基因重组子并鉴定.方法 以JEV SA14-14-2株总RNA为模板,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增JEV C蛋白编码基因,克隆至pMD19-TSimple载体测序.为便于分析JEV C蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV C蛋白编码基因5′端附加FLAG 序列,并亚克隆至pcDNA 3.1(+)载体中,构建重组子pJc并经酶切及DNA测序分析.脂质体法将pJc转染中华仓鼠卵巢(CHO)细胞.免疫荧光检测转染的CHO细胞中JEV C蛋白分布与表达.结果 pJC经BamH I/EcoR I酶切释出的插入子片段(414bp)分别与预期结果相符合.所编码的融合蛋白主要分布于胞质,少量分布于胞膜.结论 pJC成功构建,转染的CHO细胞可表达JEV C蛋白.
　　【关键词】 脑炎病毒,日本; 病毒蛋白质类; 蛋白质C; CHO细胞
　　流行性乙型脑炎(JE)DNA疫苗基因组不同区段的选取决定着最终免疫应答的复杂性,流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)prM-E蛋白编码基因重组子能够诱导免疫动物产生中和抗体,致使免疫动物免于致死量病毒攻击[1];JEV C蛋白不暴露于病毒颗粒表面,包绕于基因组RNA周围而构成核衣壳蛋白,不能诱导产生中和病毒抗体[2].已有研究表明,黄病毒C蛋白除参与病毒的组装与复制之外[3],还具有非结构蛋白的功能,提示JEV C蛋白也是JEV 感染抗病毒治疗的靶位点.
　　目前多种病毒核心蛋白编码基因重组子所致的免疫效应机制研究已经被广泛研究[4,5],然而关于JEV C蛋白的抗原性和免疫原性仍不明确,本研究构建重组真核表达质粒pJC,间接免疫荧光法探究重组质粒pJC在中华仓鼠卵巢(CHO)细胞中的表达与分布,为流JEV DNA疫苗的深入研究奠定基础.
　　1 材料与方法1.1 质粒、细胞及主要试剂:原核表达载体pMD19-T simple[Code No.D104C]购自Takara公司,用于JEV C蛋白编码基因测序.真核表达载体pcDNA3.1(+)购自Invitrogen公司,用于JEV C蛋白编码基因重组子的构建.大肠杆菌JM109与DH5α,限制性内切酶BamH I、EcoR I等均购买自Takara公司,而CHO细胞购买自中国科学研究院上海细胞库,生长于37℃,5%CO2及含有10%胎牛血清(FCS)的达氏修正依氏培养基(D-MEM)中,脂质体(Lipofectamine2000)购自Invitrogen公司,分别用于转染实验中受体细胞及转染试剂.RNA抽提试剂(Code No.D312),反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(Code No.DR027A),DNA片断纯化试剂盒(Takara,No.DV807),DNA A尾试剂盒(Takara,No.D404),琼脂糖凝胶DNA 纯化试剂盒(Takara,No.DV805),DNA 连接试剂盒(Takara,No.
　　D6023),质粒小剂量提取试剂盒(Takara,No.DV801A),大肠杆菌JM109与DH5α,限制性内切酶BamH I、EcoR I均购自Takara公司,用于重组质粒构建、转化及酶切鉴定.
　　兔抗小鼠FLAG购自cell signaling公司,异硫氰酸荧光素(FITC)标记的山羊抗兔IgG(H+L)购自北京中杉金桥公司,用于质粒转染后的免疫荧光检测.
　　1.2 JEV C蛋白编码基因重组子的构建:以JEV SA14-14-2株总RNA为模板,运用RT-PCR方法扩增JEV 核心蛋白C基因,基因两侧加入起始密码子以及终止密码子.反转录引物:5′-GAATTCTTAGGCTCCTGCACAAGCTATGAC-3′.PCR 上游引物为5′-GGATCCATGACTAAAAAACCAGGAGGGC-3′,下游引物为上述反转录引物,用于PCR上游引物和下游引物的5'端分别引入BamH I和EcoR I酶切位点.切胶回收上述PCR产物并经TaKa-Ra DNA A-Tailing Kit(Code No.D404)"A"处理,使用TaKaRa DNA Ligation Kit(Code No.D6023)将PCR产物与pMD19-T simple连接构建重组子pMD-JC.为便于分析JEV C蛋白编码基因重组子在哺乳动物细胞中的表达,在JEV C蛋白编码基因5′端附加FLAG 序列,并亚克隆至pcDNA3.1(+)载体中.PCR 扩增引物:5′-CGGGATCCATGGACTACAAGGACGACGA-TGACAAGATGACTAAAAAACCAGGAGGG-3′(下划线部分为FLAG 基因序列).将PCR 扩增产物使用TaKaRa Agarose Gel DNAPurification Kit Ver.2.0(Code No.DV805A)进行切胶回收约500bp的片段,使用BamH I和EcoR I进行酶切,经乙醇沉淀后,命名为插入DNA;将质粒pcDNA3.1(+),使用BamH I和EcoR I进行酶切,使用TaKaRa Agarose GelDNA Purification Kit Ver.2.0切胶回收约5.4kbp的DNA片段后,命名为Vector DNA;使用TaKaRa DNA LigationKit(Code No.D6022)中的Solution I,将Insert DNA 和Vector DNA 连接后,热转化至E.coli Competent CellJM109(Code No.D9052)中,涂布平板,37℃过夜培养.挑选阳性菌落植菌,提取质粒命名为pJC.使用引物BGHrev对上述质粒进行测序,结果正确.转化pJC 于大肠杆菌DH5α,小剂量提取质粒并经BamH I和EcoR I酶切电泳鉴定.
　　1.3 JEV C蛋白编码基因重组质粒瞬时转染CHO细胞:
　　采用脂质体转染法将pJC转染CHO 细胞,同时设空载体pcDNA 3.1(+)转染细胞,未转染细胞为阴性对照.具体方法为:①转染实验前天以4×105 细胞/mL接种CHO细胞于6孔板中(每孔1mL),37℃,5%CO2条件下常规培养24h至转染当天细胞达到90%以上汇合.②转染:胰酶消化转染用的CHO细胞,将其接种于6孔板中的盖玻片,以盖满玻片不溢出为度,于37℃,5%CO2的条件下常规培养24h至转染当天细胞达到90%以上汇合;配制脂质体/质粒混合物:溶液A:将pJC和空载体pcDNA 3.1(+)各4μg(每孔)加入DMEM 培养液中,溶液总体积各为250μL(每孔),轻轻混匀;溶液B:将10μL 脂质体加入240μLDMEM 培养液中,共2管,轻轻混匀,室温孵育5min;将稀释的pJC质粒和pcDNA 3.1(+)分别与250μL脂质体稀释液轻轻混匀,室温孵育20min以形成脂质体/质粒混合物;用无血清无抗生素的DMEM 培养液洗细胞3次,转染前的短时间内更换1mL 37℃预温好的无血清无抗生素的DMEM 培养液;向6孔板中逐滴加入500μL脂质体/质粒混合物,边加边摇动培养板;在37℃,5%的CO2中培养5~6h后用无血清无抗生素的DMEM 培养液洗涤细胞3次,更换含有10%FCS的D-MEM 培养液,常规培养72h.
　　1.4 免疫荧光检测:6孔组织培养板培养pJC转染的CHO细胞,待细胞密度达到60%~70%时,4%多聚甲醛固定细胞1h,0.1%Triton-100打孔10min,10%牛血清白蛋白(BSA)封闭1h,FITC标记的兔抗小鼠FLAG 4℃过夜孵育,荧光二抗37℃避光孵育1h,50%甘油封片后于荧光显微镜下观察.
　　2 结  果2.1 pJC的重组构建:以JEV SA14-14-2株总RNA 为模板,RT-PCR法获得含有FLAG片段的JEV C蛋白编码基因重组子,测序分析与发表的基因序列相符合.经酶切鉴定表明:重组质粒pJC经BamH I/EcoR I酶切释出的插入子在500bp左右,与JEV C蛋白编码基因和FLAG基因序列之和(414bp)相一致.应用pcDNA 3.1T7噬菌体启动子引物测序分析目的基因在真核表达载体中正常连接.
　　2.2 JEV C蛋白编码基因重组质粒转染的CHO细胞的免疫荧光鉴定:JEV C蛋白编码基因重组质粒转染的CHO细胞可见较显著绿色荧光标记,主要分布胞质、胞膜.单纯载体转染或未进行转染的CHO细胞中未见特异性绿色荧光标记,仅见散在的无特异性绿色荧光杂质.
　　3 讨  论JEV C蛋白在细胞核的定位对于病毒性脑炎的发病机制有着重要的意义[6].已有研究证明:
　　JEV C蛋白特异性的和核仁蛋白B23结合,JEV C蛋白氨基端残基的Gly42和Pro43对于B23结合和定位在细胞核和核仁起非常重要的作用[7].Ma等[8]研究表明,JEV 核心蛋白变异株(42,43位的甘氨酸和脯氨酸被丙氨酸替代)在核仁中找不到核心蛋白,进一步证明核心蛋白定位于细胞核对病毒  的复制和病原性起非常重要的作用.
　　本实验以JEV SA14-14-2株总RNA 为模板,经RT-PCR法获得含有FLAG片段的JEV C蛋白编码基因重组子,以定向克隆的方法将其插至真核表达载体pcDNA 3.1(+),构建重组质粒pJC,pJC经BamH I/EcoR I酶切释出的插入子大小约为414bp,经测序分析表明目的基因在真核表达载体中正常连接,提示含有FLAG 片段的pJC蛋白编码基因重组子构建成功,从分子层面说明本实验重组质粒含有JEV C蛋白编码基因;将转染JEV C蛋白编码基因重组质粒的CHO细胞免疫荧光结果显示:JEV C蛋白编码基因重组质粒转染的CHO细胞可见较显著绿色荧光标记分布在胞质与胞膜,提示本实验构建的重组子pJC能够在真核表达系统中正常表达,为下一步研究JEV DNA疫苗免疫原性等研究提供依据.