多功能干细胞和体细胞直接转化为心肌细胞的研究进展
       心血管疾病现已成为全球范围发病率和死亡率最高的疾病之一,成熟的心肌细胞是终末分化细胞,缺乏再生能力.如果心肌细胞功能出现故障或者心肌细胞大量坏死,则可导致心律失常以及心力衰竭.
　　尽管目前应用血运重建和药物治疗来阻止心功能的恶化和心律失常的发生,但并不能使心功能得到实质上的改变.如何使坏死心肌或无功能心肌再生,使其舒缩功能和起搏以及传导功能得到恢复,一直是人类需要解决的难题.近些年的胚胎干细胞移植技术使人们看到了曙光.胚胎干细胞(ESCs)来源于囊胚期的胚胎组织,是一种具有极强分化潜能和自我更新能力的多能干细胞,能分化成包括心肌细胞在内的多种细胞.通过对心肌梗死和非缺血性心肌病的动物模型移植入胚胎干细胞,使得受损心肌的功能和结构得到了显著改善.然而,在这个领域的研究仍不发达,主要是因为其低下的移植效率及伦理和免疫排斥等因素限制了其进展.此外,低下的移植效率部分程度上是由于细胞源未达到标准以及免疫抑制.多功能干细胞(iPSc)是源于早期日本科学家利用病毒载体将4个转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)转入已分化的体细胞中,将其重编程从而得到类似于胚胎干细胞的一种细胞类型.iPSc能不断地自我更新,可以分化成几乎所有身体的细胞类型,这使其有研究早期发育生物学的价值,从而来治疗人类相关疾病.另外近些年开始研究的直接从成纤维细胞重新编程的心肌细胞,这为潜在的心血管疾病治疗提供了另一种思路.
　　1 多功能干细胞诱导向心肌细胞的分化
　　近年在已经建立的具有可行性的重组成纤维细胞转化成iPSc在干细胞的生物学领域取得激动人心的突破.中山伸弥实验室仍然采用了将逆转录病毒引入Oct4、Sox2、Klf4and c-Myc4种转录因子的方法[1-2],而Thompson实验室则使用了另外一组重组因子将慢病毒引入Oct4、Sox2、Nanog andLin28的方法[3].通过这些技术能够诱导人皮肤纤维母细胞形成在形态学上与ESCs几乎完全相同的多功能干细胞.iPSc具          有胚胎干细胞的形态、生长特性并表达胚胎干细胞的标志性基因,可在体外和畸胎瘤中分化为3个胚胎层不同类型的细胞,其中就包括心肌细胞.Mauritz等[4]首次通过EBs将小鼠iPSc诱导分化为心肌细胞并且最终显示大约55%跳动的细胞.小鼠iPSc表现出与胚胎干细胞相当的分化成心肌细胞的潜力,并且与ES细胞衍生的心肌细胞相似的形态结构和电生理特征,比如舒缩功能,细胞间连接,离子通道以及受儿茶酚胺激素调节的特性等.另外还有其他的几个团队也报道了类似的结果[5-6].2009年,有2个团队从人类iPSc培养出有功能的心肌细胞[7-8].Yan等[9]将iPSc移植入心肌梗死模型的小鼠,结果发现梗死区的血管内皮细胞和新生血管平滑肌的数量都有了明显增加.尽管诸多实验证明小鼠iPSc有很强大的分化能力,但是关于通过人类iPSc分化成心肌细胞的研究仍然面临许多困难.一个主要难题是要增加从人类iPSc分化成心肌细胞的效率.而且Kattman等[10]的研究发现源自相同的纤维母细胞体系的不同iPSc系,甚至不同的iPSc克隆体,显示出了不同的心肌细胞分化效率.这种差异的原因可能是这些iPSc来自不同的重组方法或是不同的后天环境背景所造成的.
　　此外,尽管人类iPSc被证明可以分化出心肌细胞,但是在对患者进行临床试验之前,必须要经过严格的安全性测试.另一方面,人们已经能够从猪[11]、兔[12]和猴子[13-14]体细胞提取iPSc,尽管这些iPSc生成的心肌细胞还需要进一步研究.
　　2 多能干细胞的应用
　　2.1 iPSc在心血管疾病的应用前景 人类iPSc为基础和临床的相关研究带来了广阔的前景,为改善公共健康问题提供可持续的解决方案,这其中就包括了心血管疾病.虽然环境和遗传因素都是造成心脏疾病的因素,但是单基因的缺陷已经确认为直接导致的超过40种心血管疾病的病因,其中包括肥厚性心肌病和遗传性的心律失常,如家族性长QT综合征(LQTS)、短QT 综合征和传导系统异常[15].
　　目前治疗这些心脏疾病通常包括药物、设备植入、组织消融并最终进行心脏移植.心脏疾病的治疗需要病人特异性和疾病特异性药物和新的细胞源替代疗法.因而人类iPSc提供了一个前所未有的机遇,能够制造出特定病人的疾病模型、药物筛选、药物安全测试和潜在的细胞替代治疗.到目前为止,这些动物模型和非人类心肌细胞作为相关研究的主要资源被广泛应用[16-17].
　　2.2 遗传性心血管疾病模型建造和药物的研发
　　随着基因技术的完善,研究人员可以通过各种生物工程手段获得得拥有特定基因型的模型用于疾病的研究.由于此类疾病的相关细胞不能在体外生长足够的时间,这类疾病一直不能得到很好的研究和治疗.iPSc来源的疾病模型能把患者的皮肤细胞重编程,再定向分化至心肌细胞,在培养基上模拟疾病发生的过程.由于这项技术能够使我们在体外获得无限的疾病相关心肌细胞,这样就可以进行新药筛选.
　　鉴于许多心脏疾病的复杂性,最早的这种心脏疾病建模研究主要集中在单基因突变引起的心脏疾病.到目前为止,心肌肥大和心脏离子通道病的iPSc已经被建模使用.
　　Carvajal-Vergara等[18]从LEOPARD 综合征(LS)患者获取了iPSc,其中大约40%的LS病人有心脏肥大.LS iPSc有一个单个的T468M 突变的基因PTPN11(蛋白质酪氨酸磷酸酶、非受体类型11),并且他们的父母也有相同的基因缺陷.有趣的是,他们通过检测分化自肥厚性心肌病患者iPSc的心肌细胞的表型,而这个可以通过放大单元尺寸,异常的肌小节组织和细胞核因子可以证实.
　　有关心脏离子通道病建模的已经有文献报道,这其中的一种心律失常疾病长QT间期综合征,通过患者提取的的iPSc已经完成建.这12个基因的突变(KCQ1、ANK2、SCN5A、KCNH2、KCNE1、KCNE2、KCNJ2、CACNA1C、CAV3、SCN4B、AKAP9、SNTA)已被确认为是引起的遗传LQTS的主要因素,其中这些基因大多数用于编码离子通道[19].LQTS导致室颤引发的猝死,特别是在年轻人中居多[20].LQTS最常见的原因是在K+ 电压门控通道基因的突变,包括KCNQ1[类型1LQTS(LQT1)]和KCNH2[(2型LQTS(LQT2)],以及  在钠离子电压门控通道基因SCN5A[类型3LQTS(LQT3)],这些约占超过60%的遗传性LQTS案例[19].这种异常的LQTS很容易在单个细胞水平上的电生理实验中被检测到,如膜片钳技术,这样就可以通过iPSc衍生心肌细胞来建立理想的LQTS模型.一些团队已经在研究建模LQT1[21]、LQT2[22]和Timothy综合征(LQT3)[23]的可行性.
　　一些研究显示这种iPSc的动作电位时程明显延长,这种延长主要是由于心脏快速延迟整流钾电流(Iks)显著减少导致,而且这种细胞显示出明显的致心律失常性,主要表现为早期后除极和诱发性的心律失常,这与病人的临床特征相吻合.所有这些研究表明,可以通过这个新模型来人类遗传心脏病的机制研究和疾病治疗新药物的研发.
　　人类通过对患者iPSc的突破性的研究,开启了在心脏病研究领域的新时代.然而这些遗传性心脏疾病的分子病因学研究还不明朗,问题可能在于其研究需要的大量的提纯的iPSc诱导的心肌细胞.
　　此外,单从一个方面的研究LS和LQTS患者的iPSc只是描述了疾病一些方面.比如,人类iPSc与LQTS病人体内心肌细胞对药物的敏感性是不同的.
　　3 体细胞直接转化为心肌细胞
　　Ieda等[24]报道了将小鼠的成纤维细胞直接转化为诱导的心肌细胞(iCMs).研究人员通过把心肌特异的肌球蛋白重链启动子与绿色荧光蛋白融合,这样当成纤维细胞转化为心肌细胞时,就能用流式细胞仪分选检测到有荧光的细胞通过导入成纤维细胞之前应用基因微阵列发现的14个与心肌发育密切相关联的转录因子,通过每次去除1个因子和剩余因子的转化效果作对比发现,其中Gata4iCMs、Mef2c、Tbx5这3个转录因子主导了成纤维细胞向心肌细胞的转化.这种iCMs细胞与成熟的小鼠心室肌细胞十分相似.这项研究为心脏疾病的研究开发和临床应用提供新的思路.最近Qian等[25]在对小鼠体内开展的研究中取得一项突破:将形成瘢痕组织的心肌细胞直接转化为跳动的心肌细胞,在心梗发作的小鼠实验室研究中,将3个正常条件下指导胚胎心脏发育的基因Gata4、Mef2c、Tbx5直接导入心肌受损区域;一个月之内,不能跳动的通常形成瘢痕组织的心肌细胞转化为跳动的心肌细胞;在3个月之内,心脏甚至更加强烈地跳动,并泵出更多的血液.目前还需要对大型哺乳动物进行大量的临床试验来测试其安全性,以尽快投入临床试验阶段.
　　相比较的人类iPSc重新编程此ES/iPSc的分化具有长时间窗,这将为人类细胞重新编程策略提供更多更加详细的潜在机制研究价值.另外,由于心肌周围组织里有相当比例的成纤维细胞,假如直接向其注入转录因子而诱导心脏内的成纤维细胞向功能心肌细胞转化,这将是治疗心肌梗死、病态窦房综合征等功能细胞坏死的简单可行的方法.
　　综上所述,iPSc技术通过短短几年的时间,已经逐渐取得一些令人满意的成果,但是iPSc制备效率的低下和iPSc的安全性以及细胞重新编程的分子机制研究等问题还有待于解决.近几年体细胞直接转化为心肌细胞的研究已有不少进展,但是与iPSc一样存在着临床上应用的风险.随着细胞生物学、发育生物学、分子生物学、功能基因组学以及转基因技术发展,这些问题都将可能得到很好的解决.