新生隐球菌GXM 的纯化及其对巨噬细胞甘露糖受体表达调节的研究
　　【摘要】目的从新生隐球菌B3501 培养上清中分离和纯化荚膜多糖葡萄糖醛酸木糖甘露聚糖( GXM) ,观察其是否能调节巨噬细胞甘露糖受体MR 的表达.方法采用乙醇沉淀荚膜多糖,十六烷基三甲基溴化铵( CTAB) 特异性沉淀方法获得GXM,将GXM 与巨噬细胞共孵育24 h,Western blot 检测MR 的表达变化情况.结果获得了毫克级的GXM,巨噬细胞与GXM 孵育后甘露糖受体( mannose receptor,MR) 的表达没有明显变化.结论新生隐球菌荚膜多糖GXM 不影响巨噬细胞甘露糖受体MR 的表达.
　　【关键词】新生隐球菌; 荚膜多糖; GXM; 分离与纯化; 甘露糖受体; 表达
　　新生隐球菌易于感染免疫功能低下人群,如HIV 感染、器官移植及血液肿瘤患者等,由于其嗜中枢特性,常可导致致命性的中枢神经系统感染.
　　隐球菌荚膜是重要的毒力因子,组成成分包括葡萄糖醛酰木糖基甘露聚糖( GXM) 、半乳糖木糖甘露聚糖( GalXM) 和少量的甘露糖蛋白( MP) 等,其中GXM 占多糖成分的90% 以上,既可以黏附在细胞壁上形成荚膜结构,也可以释放到培养上清中.
　　GXM 可以增强隐球菌抵抗吞噬细胞的吞噬作用,也可以诱导机体产生抑制性细胞因子IL-10、抑制机体产生炎性细胞因子IL-2、TNF-α 和IFN-γ等[1-2],在隐球菌逃逸机体的抗感染免疫中发挥重要作用.我们的前期工作发现隐球菌能下调巨噬细胞MR 的表达,因此本文详细介绍了如何从新生隐球菌B3501 中分离和纯化GXM,并探讨了隐球菌GXM 对巨噬细胞MR 表达的影响.
　　1 材料与方法
　　1. 1 材料新生隐球菌采用B3501 标准株,由中国医学真菌保藏管理中心隐球菌专业实验室提供.真菌培养基采用YNB 培养基( YNB 粉末6. 7 g,葡萄糖5g,氯霉素200 mg,定容至1 L,过滤除菌) 及YPD 平板( 酵母抽提物10 g,蛋白胨20 g,氯霉素200 mg,琼脂15 g,定容至900 mL,高压灭菌,冷却至60℃后加入无菌的20% 的葡萄糖100 mL 制成平板) .
　　C57BL /6J ( H-2Kb ) 小鼠,雌性,6 ~ 8 周龄,购自上海必凯实验动物有限公司.
　　1. 2 主要试剂十六烷基三甲基溴化铵( CTAB) 、酵母氮基础( YNB) 购自Sigma,CTAB 配制成0. 3%的水溶液置常温备用.酵母抽提物、蛋白胨、氯霉素、琼脂糖、苯酚、硫酸、无水乙醇、NaCl、葡萄糖、磷酸钠均为国产分析纯试剂,DEAE 琼脂糖凝胶CL-6B 柱购自GE 公司,M-PER 蛋白抽提试剂、BCA 蛋白检测试剂盒、Western 荧光检测试剂购自Pierce,HRP 标记抗羊IgG 购自Santa Cruz,羊抗鼠MMR 抗体、内参抗体兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶( GAPDH) 抗体购自R&D 公司.
　　1. 3 方法新生隐球菌B3501 培养上清的乙醇沉淀法从平板上挑取一个菌落,接种至1 L YNB 培养基中, 30℃摇床培养3 ~ 4 d,9 000 r /min 离心收集上清,缓慢加入3 倍体积的无水乙醇,此时会出现奶状沉淀,摇匀后置4℃过夜.次日于9 000 r /min 高速离心收集沉淀,弃上清,沉淀尽量风干.加约18mL 水溶解沉淀( 有时需搅拌过夜) ,此时形成黏稠溶液,为GXM 及GalXM 多糖混合物.
　　多糖浓度的测定采用苯酚硫酸法测量多糖的含量,首先配制1% 的葡萄糖,绘制标准曲线: 取6 个玻璃管,每管加蒸馏水2 mL,按顺序每管相应加入1%的葡萄糖0、5、10、20、40、80 μL,然后加入新鲜配制的6% 的苯酚1 mL,混匀,再迅速加入5mL 浓硫酸( 注: 加浓硫酸时应迅速直接加入玻璃管中,不应沿管壁加入) ,反应过程会释放大量热量,可将玻璃管置23℃水浴降温,20 min 后于490nm 测量光密度,绘制标准曲线.同时取待测样品10、20、40 μL 按相同方法测量光密度值,取平均值测算多糖含量.
　　CTAB 沉淀GXM 常温时在上述获得的多糖溶液中加入2 mL 2 mol /L 的NaCl ( 使NaCl 终浓度为0. 2 mol /L) ,然后缓慢加入0. 3% 的CTAB,边加边搅拌,CTAB 用量应为多糖含量的3 倍,如100 mg 多糖溶液应加入0. 3% 的CTAB 100 mL( = 300 mg CTAB) ,为确保GXM 被完全沉淀,提高效率,实际操作中CTAB 用量高于理论值,直至无新沉淀产生为止.9 000 r /min 离心收集沉淀,沉淀使用10% 乙醇洗一遍,风干,此为CTABGXM复合物.然后加12 mL 1 mol /L 的NaCl 溶解沉淀,再加入2. 5 倍体积无水乙醇沉淀溶液中的GXM,此时CTAB 仍存留于溶液中,9 000 r /min 高速离心30 min,收集沉淀( GXM) ,用2mol /L 的NaCl 溶解沉淀,溶解需过夜或数日,可用超声波短暂超声,有助于GXM 溶解[3],此时会形成极其黏稠溶液,似甘油.
　　GXM 缓冲液的交换取GXM 溶液加至10KD的透析袋中,密封,将透析袋置于1 mol /L NaCl 于4℃透析1 d,再将透析液换成双蒸水透析1 周,每天换液,直至形成清亮的溶液,最后再用PBS 透析1 d,将GXM 溶液置换成PBS,酚硫酸法测量浓度后存于-80℃备用.
　　DEAE 离子交换层析鉴定GXM 离子交换层析之前将GXM 缓冲液交换为0. 01 mol /L 的磷酸钠( pH7. 1) ,然后过DEAE 琼脂糖凝胶CL-6B 柱,用磷酸钠缓冲液清洗柱子,用0. 01 mol /L 的磷酸钠/0. 3 mol /L 的NaCl 洗脱结合的GXM,每1 mL洗脱液使用苯酚硫酸法测量490 nm 的OD 值,绘制成洗脱峰.
　　GXM 与巨噬细胞共孵育实验前4 d 给予小鼠腹腔注射硫羟乙酸肉汤2 mL,实验前1 d 脱颈处死小鼠,用含10% 胎牛血清的DMEM 反复冲洗腹腔,离心收集细胞,红细胞较多时使用Tris-NH4 Cl破红处理,计数,106 /孔铺6 孔板,孵箱中培养24h,轻轻吹打去除悬浮细胞,贴壁细胞即为腹腔巨噬细胞.加入纯化的GXM,使其终浓度为30 μg /mL,阴性对照组加入与GXM 同体积的PBS ( 磷酸盐缓冲液) ,阳性对照组加入200 ng /mL 的LPS( 脂多糖) ,继续培养72 h.
　　Western blot 鉴定培养的巨噬细胞用2 mLPBS ( pH7. 4) 清洗两遍,加蛋白裂解液于冰上裂解20 min,BCA 法测定浓度后调整蛋白浓度一致行SDS-PAGE 电泳,随后以100 V 恒电压于4℃ 90min 转至硝酸纤维素膜上,5%脱脂牛奶的TBST 室温封闭2 h,抗MR 一抗室温孵育2 h,TBST 洗膜15min、3 次,HRP 标记的抗羊IgG 二抗室温孵育2 h.
　　TBST 洗膜15 min、3 次,然后加入ECL 化学发光底物作用1 min,置暗室曝光显影并拍照.
　　2 结果2. 1 多糖含量的测定首先我们用酚硫酸法测量了不同含量的葡萄糖在490 nm 的光密度值,纵坐标为糖含量,横坐标为OD 值,绘制了标准曲线( 见图1) ,得到了多糖含量的计算方程: Y = 690. 6X-68. 91,Y 代表多糖含量( μg) ,X 代表OD 值.待测样品3 管,分别测其OD 值为0. 159,0. 227,0. 351,换算浓度分别为4.
　　09,4. 39,4. 34 mg /mL,取平均值为4. 27 mg /mL,多糖溶液体积为18 mL,表明我们从1 L 培养上清中获得了GXM 及GalXM 多糖混合物77 mg.
　　2. 2 GXM 含量的测定多糖经CTAB 特异性沉淀GXM,再使用乙醇沉淀CTAB-GXM 溶液中的GXM,透析后最终获得11 mL GXM 溶液,同样取3 管( 40 μL、80 μL、160μL 样品) 使用酚硫酸法测量其浓度,分别为2. 82、3. 08、3. 1 mg /mL,取平均值为3 mg /mL,获得了约33 mg 的GXM,得率为42. 9% ( 33 /77) 与CherniakR 等人报道一致[3].但Wozniak 等报道每升培养上清中可获得高至200 mg 的GXM[4],我们的纯化效率稍微有点低,这可能是因为乙醇沉淀的时候没有加醋酸钠,在醋酸钠存在的情况下可以增加乙醇沉淀多糖的效率.
　　2. 3 离子交换层析鉴定GXM 纯度根据文献报道[3],我们使用DEAE 离子交换层析初步鉴定了GXM 的纯度,由图2 可见,GXM 洗脱后表现为单一的洗脱峰,表明所纯化的GXM 的纯度是比较高的,我们成功获得了高纯度的GXM,为下一步研究打下了基础.
　　2. 4 GXM 不影响巨噬细胞甘露糖受体MR 的表达接下来我们通过western blot 观察了GXM 对巨噬细胞MR 表达的影响,我们发现,30 μg /mL 的GXM 处理巨噬细胞72 h 后,MR 的表达在蛋白水平与PBS 处理的空白对照组相比无明显差异,200ng /mL 的LPS 处理72 h 的阳性对照组MR 的表达明显下降( 见图3) ,表明MR 的表达不受GXM 的调节.
　　3 讨论GXM 的分离和纯化在国外多个实验室均有报道,一般均采用乙醇及CTAB 沉淀法,但是国内尚缺乏该方面的研究报道.Cherniak[3]等人报道采用高压或福尔马林处理隐球菌可提高GXM 的产量,同时也报道了单纯乙醇沉淀多糖的效率是最低的,丙酮与乙醇联合使用可以明显提高纯化效率.
　　另使用乙醇及醋酸钙沉淀法可获得最大产量,但因为醋酸钙易形成沉淀,影响后续实验的进行.我们也曾采用过Wozniak[4]等人报道的方法纯化GXM,即乙醇沉淀的时候同时加用醋酸钠,沉淀的多糖含量明显高于单纯乙醇沉淀法,但沉淀很难溶解,一方面是因为GXM-GalXM 混合物本身难溶,另一方面是由于醋酸钠在乙醇沉淀的时候也容易形成沉淀,此时往往需要加冰醋酸溶解沉淀.对于一般实验而言,不使用醋酸钠也能达到所需要的产量.另外,CTAB 在低温的时候难于溶解,因此实验过程中尽量控制在室温,避免CTAB 低温形成沉淀影响最终实验结果.如果透析完后GXM 浑浊,表明CTAB 没有完全去除,此时需用1 mol /L 的NaCl 重新透析,以便将残余的CTAB 清除干净.若需要做免疫学相关实验,尚需要测量GXM 的内毒素含量,实验过程中为了防止内毒素污染,应尽量使用一次性实验器材,使用超纯无内毒素水.
　　GXM 可从新生隐球菌和格特隐球菌( 血清型A-D) 中分离纯化,是隐球菌荚膜的重要组成部分,是毒性因子之一,除了抗吞噬、诱导免疫抑制外,在隐球菌脑膜炎发病中,有荚膜株比无荚膜株可以更快地穿过脑血管内皮细胞,并且在隐球菌穿过血脑屏障后,荚膜多糖的大小和结构都发生了变化[5],表明荚膜在隐球菌病发病中具有多方面的功能.
　　GXM 还可以通过Fas 配体诱导巨噬细胞凋亡[6],可以抑制白细胞的迁移[7]、损害粒细胞抗隐球菌活性[8],也可以诱导或抑制机体产生多种细胞因子,其中有的报道GXM 能促进TNF-α 的产生[9],也有报道GXM 能抑制TNF-α 的产生[2].因此有关GXM 的生物学功能尚未完全明确,需进一步研究.
　　甘露糖受体MR 也叫CD206,是一大小为175KD 的跨膜糖蛋白,不仅表达于巨噬细胞,还表达在未成熟树突状细胞( dendriticcells,DCs) 、视网膜上皮细胞及肝脏内皮细胞等[10].DCs 通过MR 识别新生隐球菌甘露糖蛋白( mannoprotein,MP) ,内吞并递呈甘露糖蛋白抗原给T 细胞,诱发机体的抗感染免疫[11].我们的前期实验发现新生隐球菌能下调DCs 和巨噬细胞MR 的表达,鉴于MR 在抗隐球菌感染免疫中的重要作用,我们推测隐球菌下调MR 的表达有可能是其逃逸机体免疫应答的一个新机制[12].因此我们观察了新生隐球菌GXM 对巨噬细胞甘露糖受体MR 的表达影响.实验结果表明GXM 不能下调MR 的表达,说明隐球菌可能是通过其他荚膜或菌体成分诸如甘露糖蛋白等下调MR 的表达的.关于隐球菌下调MR 表达的具体机制尚需进一步研究.