【摘要】  目的 探讨体外水平利用化学修饰的小干扰RNA(siRNA)敲减含激酶插入区受体(KDR)基因治疗乳癌的可行性和特异性.方法 采用阳离子脂质体Lipofectamine 2000TM作为转染试剂,将针对人KDR基因的siRNA转染人乳癌细胞株MCF7敲减KDR基因的表达.通过Hoechst 33258染色观察MCF7细胞的凋亡情况;采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测NES1基因和RUNX3基因甲基化状态和mRNA的转录水平.结果 靶向KDR的siRNA转染MCF7细胞后可诱导细胞凋亡,NES1基因和RUNX3基因甲基化程度降低,出现非甲基化条带,同时mRNA表达上调.结论 KDR siRNA在体外能逆转MCF7细胞的NES1基因和RUNX3基因甲基化,并诱导细胞凋亡.
　　【关键词】  RNA干扰;MCF7细胞;血管内皮生长因子受体2;甲基化;细胞凋亡
　　[ABSTRACT] Objective To investigate the feasibility and specificity of gene therapy for breast cancer by using KDR gene expression through chemically modified siRNA in vitro. Methods The siRNA was transfected into MCF7 cells by using cationic liposome Lipofectamine 2000TM to knockdown KDR gene. Apoptosis was measured by Hoechst 33258 staining; methylation specific PCR (MSP) assay was used to analyze the methylation status of NES1 and RUNX3 gene; the expressions of mRNA of NES1 and RUNX3 gene were detected by reverse tranｓｃｒｉｐｔionpolymerase chain reaction (RTPCR). Results siRNA directed against KDR induced the apoptosis of MCF7, lowered the degree of NES1 and RUNX3 methylation, the unmethylation appeared, and, meanwhile, upregulated the expressions of mRNA. Conclusion KDRsiRNA can, in vitro, reverse the methylation of NES1 and RUNX3, and induce apoptosis.
　　[KEY WORDS] RNA interference; MCF7 cells; vascular endothelial growth factor receptor2; methylation; apoptosis
　　恶性肿瘤生长过程中,肿瘤组织内血管的再生是肿瘤组织内细胞急剧、持续性增殖的病理生理学基础.有研究认为,含激酶插入区受体(KDR),即血管内皮生长因子受体2(VEGFR2) 是血管内皮生长因子(VEGF)发挥功能的主要受体,其不仅分布于组织的血管内皮细胞,也分布于部分肿瘤细胞(MCF7细胞、HL60细胞等),对于肿瘤增殖与新血管形成起重要作用[1].RNA干扰(RNAi)是由双链RNA(dsRNA)引起的基因沉默现象,它通过降解具有同源序列的mRNA而起作用,特殊设计的小干扰RNA(siRNA)能使靶基因发生特异性沉默[2].前期研究显示,KDR siRNA转染乳癌细胞株MCF7后可抑制细胞增殖.本研究旨在进一步探讨其对MCF7细胞凋亡的诱导作用和对抑癌基因甲基化的影响,为其应用于临床提供理论和实验依据.
　　1 材料和方法
　　1.1 材料
　　1.1.1 细胞株 人乳癌细胞株MCF7购自中国协和医科大学基础学院细胞中心.常规培养于含体积分数0.10胎牛血清的DMEM(GIBCO公司产品)培养液中,置于含体积分数0.05的CO2、37 ℃饱和湿度的孵箱中培养传代.
　　1.1.2 主要试剂 DMEM培养基、Lipofectamine 2000TM及Trizol Reagent由Invitrogen公司生产;AMV逆转录试剂盒由Bioer公司提供;细胞凋亡Hoechst染色试剂盒(c0003)为Beyotime公司产品;基因组DNA修饰试剂盒由Zymo公司提供.
　　1.2 siRNA设计合成
　　根据文献[3]确定KDR siRNA序列,其正义链为5′GCCACCAUGUUCUCUAAUATT3′,反义链为5′UAUUAGAGAACAUGGUGGCAT3′;阴性对照siRNASCR序列正义链为5′UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3′,反义链为5′ACGUGACACGUUCGGAGAATT3′.两段siRNA序列均行BLAST对比确保与其他基因没有同源性.为增强siRNA的稳定性,对正义链进行甲基化修饰,反义链不修饰,并由上海吉玛制药技术有限公司合成.
　　1.3 转染
　　根据Lipofectamine 2000TM试剂操作指南,采用通用型荧光标记的阴性对照siRNA进行转染条件的优化.取对数生长期的细胞,调整细胞密度,接种于12孔板,用含体积分数0.10血清、不含抗生素的DMEM培养,次日细胞贴壁后弃去旧培养液待转染.siRNA与Lipofectamine 2000TM分别用适量不含血清和抗生素的DMEM稀释,5 min内将其混合,室温静置20 min后加入细胞孔中,细胞置于培养箱进行常规培养,6 h后荧光显微镜下观察.选用siRNA与Lipofectamine 2000TM最佳转染比例.
　　1.4 Hoechst 33258染色检测细胞凋亡
　　将处理好的盖玻片置于6孔板内,取对数生长期细胞,调整细胞密度并接种于6孔板,设立空白对照组(只加无血清无抗生素培养基)、脂质体组(每孔只加Lipofectamine 2000TM 0.5 μL)、3个siRNA浓度(50、100、200 nmol/L)组、错义序列(siRNASCR)组(100 nmol/L),每组做6个平行孔,按1.3的方法进行转染.继续培养48 h后弃培养液,每孔加入固定液0.5 mL,固定10 min后弃去固定液,使用PBS洗2次,每次3 min,吸尽液体.每孔再加入0.5 mL Hoechst 33258染色液,染色5 min,弃染色液,用PBS洗2次,吸尽液体.滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上,盖上贴有细胞的盖玻片,使细胞位于盖玻片与载玻片之间,尽快在避光的条件下用荧光显微镜进行观察和拍照,可检测到呈蓝色的细胞核.
　　1.5 半定量 RTPCR 检测mRNA表达水平
　　收集转染24 h细胞,按照Trizol试剂盒操作说明提取细胞总RNA,所提RNA溶于20 μL无酶水中,Eppendorf核酸定量测定仪测RNA浓度和纯度,并于8 g/L的琼脂糖凝胶上电泳,观察RNA的完整性.以1 μg总RNA为模板,按照AMV逆转录试剂盒说明操作反转录成cDNA,其反应体系为10 μL,反应条件是室温 10 min,55 ℃ 45 min,95 ℃ 5 min,冰浴 5 min.取逆转录产物cDNA 1 μL,按照2×EasyTaq PCR SuperMix试剂盒说明书操作,PCR反应体积25 μL,并以无酶水作为阴性模板对照.各基因PCR扩增条件略有差异(表1).PCR产物均在质量浓度20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳,观察拍照,并应用天能分析软件对条带进行吸光度(A)扫描,检测各组mRNA扩增产物与其对应的内参照GAPDH或βactin mRNA扩增产物A值,然后将A目的/A内参照的比值进行统计学分析.表1 NES1和RUNX3基因引物序列、长度及退火温度基因长度(bp)引物序列退火温度
　　1.6 亚硫酸氢钠修饰和甲基化特异性PCR(MSP)
　　提取细胞基因组DNA,用EZ DNA MethylationDirect KitTM修饰试剂盒对DNA进行亚硫酸氢钠修饰,使未甲基化的胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶则无变化.以修饰后DNA作为模板, 分别使用甲基化和非甲基化特异性引物扩增NES1基因和RUNX3基因(表2).每次PCR均设阴性对照,用双蒸水代替DNA进行PCR扩增.取PCR产物10 μL,在20 g/L的琼脂糖凝胶上电泳,紫外线灯下照相.表2 MSP引物长度和序列基因长度
　　2 结 果
　　2.1 普通显微镜下观察细胞形态的变化
　　转染KDR siRNA 48 h后,倒置显微镜下观察显示,贴壁生长的MCF7细胞皱缩、变圆,部分细胞死亡脱落.
　　4期许秀娥,徐宏伟,葛银林,等. KDR siRNA对乳癌细胞凋亡和NES1与RUNX3基因甲基化影响297
　　2.2 荧光显微镜下观察Hoechst 33258染色后细胞形态学变化
　　荧光显微镜下,对照组细胞核完整均一,着色暗淡,形态规则,可见少量染色质凝聚;药物作用48 h后可见大部分细胞质染色不均匀,染色质凝聚,细胞核裂解,有的可见核碎裂及凋亡小体.
　　2.3 NES1和RUNX3 mRNA表达的变化
　　siRNA干预24 h后,100和200 nmol/L KDR siRNA组,NES1和RUNX3因发生甲基化而转录沉默的mRNA转录活性恢复,扩增出特异性条带,但100和200 nmol/L KDR siRNA组间mRNA表达比较差异无显著意义;未转染组、脂质体组、错义组及50 nmol/L KDR siRNA组均无特异性扩增条带(图1).
　　2.4 NES1和RUNX3甲基化的状态
　　KDR siRNA干预48 h后,在未转染组、脂质体组、错义组及50 nmol/L KDR siRNA组甲基化引物扩增出条带,而非甲基化引物未扩增出条带;100和200 nmol/L KDR siRNA组均同时出现甲基化和非甲基化条带(图2).
　　3 讨 论
　　研究表明,阻断KDR表达可诱导细胞凋亡[6].本实验结果与该结论一致.siRNA是RNAi作用中不可缺少的重要环节[7].体外合成siRNA的应用则是RNAi技术的新发展,尤其是在特异性抑制哺乳动物基因方面,既可以特异性地抑制、降解同源mRNA序列,有效阻止相应蛋白表达;又可避免长链dsRNA引起的非特异性基因降解和细胞死亡,为哺乳动物细胞的基因治疗开辟了新的途径[8].
　　DNA甲基化状态的改变可导致基因结构和功能的异常,而其与乳癌发生的关系是近年来研究的热点.DNA甲基化状态与基因表达呈负相关.研究表明,抑癌基因CpG岛甲基化导致基因失活和转录抑制[9].NES1又称人组织激肽释放酶10(Kallikren10),此基因位于19号染色体q13.3位置上,DNA大小约5.5 kb,含6个外显子(其中1个未被翻译)和5个内含子,转录1.4 kb mRNA,编码一条含276个氨基酸的蛋白[10],在调控正常上皮细胞生长分化等方面起一定作用.LI等[4]研究显示,NES1外显子3甲基化与乳癌细胞系及原发性肿瘤NES1特异性表达缺失有关.hRUNX3基因定位于人染色体1p36.1上,基因全长6.7×104 bp,含6个外显子及p1、p2两个启动子,其mRNA主要由p2启动子转录,p2启动子CG含量丰富(64%),是一个典型的CpG岛.该基因能调控细胞生长发育和凋亡,QUEK等[5]报道,RUNX3在MCF7中完全甲基化, 而DNA甲基化的可逆性特征为临床抗肿瘤治疗提供了一种新的途径.
　　本实验选用化学合成方法获得siRNA,并对siRNA进行核苷酸戊糖2′羟基的甲基化修饰.然后,以阳离子脂质体为转染试剂,应用FAM6羧基荧光素标记的通用型阴性对照优化转染条件,得到siRNA与Lipofectamine 2000TM最佳的质量体积比为10 pmol∶0.5 μL.KDR siRNA转染MCF7细胞后,使抑癌基因NES1和RUNX3的甲基化降低,同时使MCF7细胞重新表达NES1和RUNX3的mRNA,促进肿瘤细胞凋亡,其具体的作用机制还有待于进一步的研究.
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