【摘要】:空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药性及其与细菌适应性/毒力的关系在当今世界备受关注.已有的研究显示空肠弯曲杆菌对大环内酯类的耐药机制主要包括23SrRNA基因V区的位点突变、核糖体蛋白L4和L22的氨基酸突变、外输泵蛋白的表达调控和其他未知机制.近两年来,

虽然已有报道显示23SrRNA基因上的耐药突变会导致细菌的适应性代价, 医药卫生类杂志征稿投稿但是其他类型的耐药突变(包括核糖体突变、核糖体和23SrRNA基因的联合突变等)对细菌适应性的影响尚未见报道.虽然流行病学调查的数据显示大环内酯类耐药空肠弯曲杆菌比敏感菌的致病性更强,然而目前尚无直接的实验数据来分析其耐药性和毒力的关系.随着组学研究的发展,基因芯片技术为更深入、系统研究空肠弯曲杆菌耐药性、适应性和毒力的作用机制提供了有利工具.本研究首先应用不同种大环内酯类药物(包括红霉素、泰乐菌素和替米考星)体外长期诱导敏感性空肠弯曲杆菌,并测序鉴定耐药菌株的突变类型.体外比较了各种耐药突变菌相对敏感菌的适应性(竞争生长力)、生长性能、热耐受力.特别比较了含有23SrRNA基因A2074C突变的耐药菌和敏感菌在体外培养基、细胞和动物模型中的相对生长力、定植力和侵袭力,初步分析了23SrRNA基因上的A2074C耐药突变和细菌毒力的相关性.为深入分析大环内酯类耐药性与细菌毒力的作用机制,23SrRNAA2074C突变菌及其母源敏感菌被配对杂交,进行基因芯片分析.在芯片结果分析的基础上,本研究还考察了亚抑菌浓度的药物对细菌鞭毛合成、组装及细菌迁移力(一种重要的毒力指标)的影响.测序结果显示体外诱导的各耐药菌含有不同类型的位点突变,包括23SrRNA基因上的A2074C或A2075G突变、核糖体蛋白L4编码基因(rplD)的G170A突变以及核糖体蛋白L22编码基因(rplV)上的G257A突变.

此外,有一株耐药菌不仅含有23SrRNAA2074C突变而且在rplV的265位存在AGTCGT的插入突变.这些含有不同位点突变的耐药菌表现了不同程度的生长下降和适应性减弱.然而在热耐受实验中,进行热处理以后,所有菌的数量都严重下降,所以无法比较耐药菌和敏感菌的差异.本实验特别比较了23SrRNAA2074C突变菌与敏感菌的毒力特性.其小鼠定植实验结果显示突变菌和敏感菌单独接种到小鼠体内后的21天内,两菌的定植力没有显著差异;然而当两菌配对接种时,耐药突变菌在定植7天后就被清除,而敏感菌则可以继续定植至21天.胆汁耐受实验结果显示耐药菌比敏感菌的胆汁耐受力稍强,但两者没有显著差异.细胞侵袭实验结果显示耐药菌对肠上皮细胞和鼠巨噬细胞的粘附和侵袭力比敏感菌弱,并且耐药菌在巨噬细胞中的存活时间比敏感菌短.基因芯片结果显示23SrRNAA2074C耐药突变菌中的上调表达基因主要包括一些蛋白质代谢和能量代谢基因及一些未知功能基因;而下调基因则主要参与细菌的迁移和热应激.当使用亚抑菌浓度(sub-MIC)的大环内酯类药物处理后,空肠弯曲杆菌在0.4%MH琼脂平板上的迁移力受到抑制.在电子显微镜下,细菌鞭毛缺失.然而SDS-PAGE和免疫印迹实验结果却显示药物处理对空肠弯曲杆菌鞭毛蛋白的合成并没有影响.由此推测大环内酯类药物可以抑制细菌鞭毛体的组装而不会影响鞭毛蛋白本身的合成.总结全文,本研究发现在空肠弯曲杆菌对大环内酯类药物的耐药突变种中,核糖体蛋白L4和L22上的突变会导致细菌的适应性代价,并且当核糖体和23SrRAN基因上同时出现突变时,细菌表现高水平耐药和严重的适应性代价.

此外,与流行病学调查结果不同的是,本实验的结果显示红霉素耐药菌的毒力比敏感菌弱,可能是由于临床耐药菌长期处于病人的病理状态和药物治疗的环境中的缘故.最后,本实验还发现大环内酯类药物的诱导过程或亚抑菌浓度的药物处理会影响细菌鞭毛体的形成,使空肠弯曲杆菌的迁移力丧失.
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