西尼罗病毒前膜蛋白在果蝇细胞S2 中的表达与鉴定
　　摘要: 目的克隆西尼罗病毒(WNV)前膜蛋白(prM)基因,将其在果蝇细胞(S2)中表达,为制备研制诊断试剂所需的单克隆抗体奠定基础.方法以质粒WNV-CME 为模板,PCR 扩增获得prM 基因,与T 载体连接,测序正确后酶切,酶切产物与果蝇表达载体pMT / Bip / V5-HisC 重组,重组质粒与pCoBlas 共转染果蝇S2 细胞,25 μg / ml Blasticidin 筛选获得抗性细胞, 500 μmol / L CuSO4溶液诱导表达,72 h 后收集细胞与细胞上清进行Western blot 鉴定.结果酶切与测序结果表明成功构建重组表达载体WNV-prM-pMT,Western blot 显示目的蛋白在果蝇细胞S2 内稳定表达.结论在果蝇S2 细胞内成功地稳定表达WNV prM 蛋白,为下一步WNV 单克隆抗体的制备奠定了实验基础.
　　关键词: 西尼罗病毒, 前膜蛋白, S2 细胞
　　西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)是一种嗜神经组织、虫媒传播的黄病毒, 与黄热病、圣路易脑炎、登革热、日本脑炎、丙型肝炎等病毒同属.1937年发现于非洲乌干达西尼罗河地区而得名.WNV 主要通过鸟-蚊-鸟、人、马等动物传播,但随后发现输血、器官移植、哺乳、宫内感染、经破损的皮肤黏膜接触等皆可传播.WNV 感染后可导致西尼罗热以及中枢神经系统的病变如脑炎或脑膜炎.90 年代中期以后,WNV 的爆发范围和强度明显增加,病情严重,病死率高[1].WNV 在非洲、中东、欧洲与亚洲都有流行,1999 年出现于美国纽约后迅速传播至墨西哥、古巴、哥伦比亚等国家[2].WHO 已将其列为当前全球的重大流行病之一.
　　前膜蛋白(prM)是WNV 成熟病毒颗粒中M 蛋白的前体形式,在病毒释放前,胞浆内的病毒颗粒中含有prM ,prM 蛋白和E 蛋白间的相互作用决定着整个病毒颗粒的稳定性,是黄病毒稳定其亚病毒构成的决定性因素.有研究表明,在细胞中同时表达prM 和E 蛋白, 可以自组装成病毒样颗粒(VLPs).
　　表达WNV 的结构蛋白prM / E 和CprM / E 在昆虫细胞内产生的WNV 样颗粒(WNV-LPs) 有可能成为WNV 疫苗的有效候选分子[3-4].WNV 与登革病毒能产生严重交叉反应,因此,在登革热病毒流行的广东等东南亚区域鉴别诊断方法的建立,还需与其它发热疾病和出血热疾病区分.日本脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus,JEV)的prM 蛋白与乙脑阳性血清发生反应,而WNV 的prM 蛋白不与乙脑阳性血清反应,可用于鉴别WNV 与JEV 的感染,具有重要的诊断价值[5].本研究拟在果蝇S2 细胞中分泌表达prM蛋白,为制备研制诊断试剂所需的单克隆抗体奠定基础.
　　1 材料与方法
　　1.1 材料果蝇S2 细胞(Drosophila expressionsystem,DES 表达系统)、pMT / Bip / V5-HisC 载体、pCoBlast 载体、TOP10 感受态细胞由本实验室保存;限制性内切酶购自纽英伦生物技术(北京)有限公司;DNA 聚合酶购自Agilent Technologies 公司;琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、FuGENE誖HD Transfection Reagent 购自罗氏公司;PMD 19-Tsimple Vecoter、DNA Ligation Kit 购自TAKARA 公司;V5 抗体和S2 细胞Schneider 培养基购自Invitrogen 公司;胎牛血清购自Gibco 公司.
　　1.2 prM 基因的扩增根据GenBank 中发表的序列设计一对引物,引入NcoⅠ与NotⅠ酶切位点,用以扩增prM 基因片段.prM-F 5′-CATGCCATGGCCGGAGGAAAGACCGGAAT-3′(NcoⅠ);prM-R 5′-ATAAGAATGCGGCCGCGGTGTTGCTCCCA-3′(NotⅠ),引物由Invitrogen 公司合成,以WNV-CME 质粒为模板,EasyA 高保真酶扩增prM 基因,98℃预变性2 min,94℃变性45 s,58℃退火45 s,72℃延伸45 s,28 个循环后72℃延伸10 min,1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物.
　　1.3 prM 基因与T 载体的连接PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶回收后与PMD19-T simple Vector 连接,连接产物转化TOP10 感受态细胞,转化后挑取多个菌落进行PCR 鉴定,阳性者进行测序鉴定.
　　1.4 prM 基因与表达载体pMT / Bip / V5-HisC 的连接与鉴定测序正确的WNV-prM-PMD19-T simpleVector 与表达载体用限制性内切酶NcoⅠ 、NotⅠ进行双酶切鉴定,酶切的目的片段凝胶回收后应用DNA Ligation Kit 进行连接,连接产物转化TOP10 感受态细胞,转化后挑取多个菌落进行PCR 与双酶切以及测序鉴定.
　　1.5 S2 细胞的转染与筛选调整S2 细胞浓度至1×106 / ml 于2 ml 培养基中,6 孔板过夜培养至2×106 / ml;在100 μl Opti-MEM 加入4 μg 除菌的重组质粒DNA(WNV-prM-P MT)、6 μl FuGENE HD、0.2 μgpCoBlast,轻弹试管混匀试剂,室温放置15 min;将混合液加入6 孔板细胞内,轻轻晃动6 孔板使之混匀.
　　转染24 h 后将细胞移入25 cm2 培养瓶中,同时用筛选培养基进行培养.间隔2~3 d 换液1 次,观察细胞死亡情况.
　　1.6 S2 抗性细胞的诱导表达与鉴定加入终浓度500 μmol / L 的CuSO4溶液进行诱导表达,72 h 后收集表达上清与细胞,将表达上清与细胞裂解后上清经12%SDS-PAGE 凝胶分离, 恒流转移至PVDF 膜上,4℃过夜,用5%脱脂奶粉封闭过夜,TBST 洗膜5min×3 次,加入1∶5 000 稀释后V5 抗体,室温1.5 h,TBST 洗膜5 min×3 次,加入1∶10 000 辣根过氧化物酶标记的鼠抗人二抗,室温1 h,TBST 洗膜5 min×3次,显色,压片.
　　2 结果
　　2.1 prM 基因的PCR 扩增以WNV-CME 质粒为模板,使用设计的prM-F、prM-R 进行PCR,以EasyA高保真酶扩增prM 基因目的片段.PCR 产物经1%琼脂糖凝胶电泳可见清晰的目的片段条带, 与设计的prM 基因(501 bp)相符2.2 pMT-prM 重组质粒的双酶切鉴定提取菌液PCR 阳性的质粒双酶切, 酶切片段符合prM 基因(501 bp)结果(图2),测序结果与GenBank 中序列完全一致.
　　2.3 prM 蛋白表达、鉴定Western blot 显示S2 抗性细胞表达分泌了prM 蛋白(Mr=26 000),与预期相符,具有生物学活性(图3).
　　3 讨论
　　WNV 主要通过鸟与蚊子传播,可引起马与人类患病.大约80%的患者表现为无症状的隐性感染,严重者表现为急性发热、头痛、肌肉酸痛、关节痛、皮疹以及胃肠症状.少数感染者、免疫缺陷者、老人可出现中枢神经症状.WNV E 蛋白在病毒的粘附融合等方面扮演重要角色,而前膜蛋白prM 蛋白是一种伴侣蛋白,可以协助E 蛋白的成熟,两个重要的结构蛋白以prM/ E 异质二聚体的方式存在.N-糖基化在蛋白质的加工和转运过程中发挥着重要的作用,近年来越来越多的研究表明N-糖基化对病毒的毒力、复制、感染和免疫等都具有重要的生物学功能.
　　文献证明,与WNV 相似的日本乙型脑炎病毒prM 或E 蛋白N-糖基化位点缺失时,E 蛋白的分泌都会受到极大的影响,prM 蛋白中的N-糖基化对于病毒样颗粒的形成具有决定性的影响[6].
　　果蝇S2 表达系统(Drosophila expression system,DES)是杆状病毒表达系统之外,另一表达外源基因最常用的昆虫表达系统,与哺乳细胞表达系统都属于真核表达系统, 但S2 表达系统是经过筛选的稳定表达细胞株,表达量高于哺乳细胞表达系统.与原核细胞表达相比,表达的外源蛋白能进行正确折叠、糖基化修饰等翻译后加工过程,结构和功能更接近天然蛋白, 同时表达产物可分泌至培养基中,易于纯化.本实验采用的S2 细胞对环境要求不高,无需CO2与血清即可在室温条件下高密度培养,同时半贴壁生长特性使其易于规模化生产[7].基因组可整合多拷贝的表达质粒,能够选择出高表达的多克隆稳定细胞系,内源性表达的果蝇细胞蛋白不与哺乳动物细胞蛋白相互作用,提供了蛋白功能研究的空白背景[8].
　　西尼罗病毒单克隆抗体的制备主要集中于重组E 与NS1 蛋白,国内也有相关的研究[9-10].在国外,Focus 公司使用黄病毒和获CDC 批准的WNV 重组蛋白作抗原,PANBIO 公司则使用纯化的灭活病毒作抗原,PANBIO 公司的IgM 和Focus 公司IgG、IgM检测试剂盒已获得FDA 批准[11].有研究表明,金标准的空斑减少中和试验鉴别黄病毒之间的交叉反应,病毒样颗粒比病毒感染组织具有更高的安全性,同时还可缩短诊断时间[12].国内还未见对WNV prM 的相关报道,由于prM 蛋白有穿膜蛋白以及S2 表达系统的优点,本实验通过对WNV prM 在S2 细胞中表达条件的优化,获得了prM 蛋白,为下一步WNV 诊断用抗体的制备提供了抗原储备,进而为预防WNV可能在我国流行提供有力的检测与预防工具.