丹尼斯凤梨细菌性软腐病拮抗细菌的筛选及鉴定
　　摘要:从丹尼斯凤梨根际土壤中筛选到687 株菌株,其中菌株A2对丹尼斯凤梨细菌性软腐病具有高效拮抗作用,进行形态观察,生理生化特性测定及16S rDNA 序列分析,将菌株A2鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis).将菌株A2的抑菌作用与几种杀菌剂的抑菌作用相对比,发现A2的抑菌作用仅次于农用链霉素.
　　关键词:丹尼斯凤梨, 细菌性软腐病, 拮抗细菌, 鉴定
　　丹尼斯凤梨(Guzmania denise)因株型美观、叶色浓绿有光泽、花色鲜红且花期长而深受广大消费者喜爱[1].细菌性软腐病是种植区丹尼斯凤梨上的一种致死性病害, 感病植株表现叶腐、心腐两种症状.心腐型:初发期叶质变半透明,边缘逐渐变黄褐色,逐渐腐烂同时伴有腐臭味,严重者轻轻即可从腐烂处拉断,与茎部脱离.严重时向下蔓延至根部,病组织软腐,导致植株死亡.叶腐型:初发病时叶片上出现暗绿色水渍状病斑,逐渐延叶脉扩展,病组织变褐色软腐,与健康组织界限分明.发病后期病组织腐烂干枯, 至整株死亡[2].化学防治目前依然是软腐病的主要防治方法之一[3-5],长期使用化学农药还会诱发病菌产生耐药性[4].目前, 筛选具有拮抗作用的微生物防治丹尼斯凤梨细菌软腐病国内还未见报道.本研究筛选出对丹尼斯凤梨细菌软腐病病原菌有明显拮抗作用的菌株A2并对该菌株进行了鉴定.
　　1 材料与方法
　　1.1 试验材料供试土壤样品分别采自中国热带农业科学院凤梨基地、海口市三江镇菠萝田、海南省热带生物资源可持续利用重点实验室凤梨花盆凤梨根际.供试培养基为NA[6].牛肉膏蛋白胨培养液[6]:NA 不加琼脂粉.供试病原菌:菊果胶菌玉米致病变种Pectobaeterium chrysanthemi pv.zeae,在海南省热带生物资源可持续利用重点实验室保存菌种.生理生化试验对照菌株:S55 枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis), 在海南省热带生物资源可持续利用重点实验室保存菌株.
　　1.2 试验方法
　　1.2.1 生防细菌的分离与纯化称取土壤样品5 g, 放入含50 mL 无菌水的三角瓶中,摇床震荡10~20 min,取上清液梯度稀释至浓度为10-1、10-2、10-3、10-4,用移液枪分别吸取0.02 mL 稀释液,移入灭菌后的培养皿内,并将熔融态的NA(温度以不烫手为宜)倒入培养皿中,充分混匀,每处理3 次重复.做好标记,置于28℃恒温培养箱内培养.待长出菌落后,挑取单菌落转接到新培养基上,纯化后接于试管斜面保存备用.
　　1.2.2 拮抗细菌抑菌作用测定(1)拮抗细菌抑菌作用.
　　取摇菌24 h 的病原菌菌液5 mL, 倒入熔融状态的NA 中(温度以不烫手为宜),充分混匀,倒平板,待冷却后,在培养皿中央接一环拮抗细菌,3 个重复, 同时以不接拮抗细菌作为对照,封口后放入28℃恒温培养箱内培养.当对照长满皿时,测       量抑菌圈大小.
　　(2)拮抗细菌发酵滤液的抑菌作用.选取拮抗效果最好的拮抗细菌接于牛肉膏蛋白胨液体培养基内, 摇床28℃、150 r/min 振荡培养72 h.取一定量的发酵液于10 000 r/min 条件下离心10 min, 取上层清液用细菌过滤器过滤.取已摇菌24 h 的病原菌液5 mL,倒入熔融状态的NA 中(温度以不烫手为宜),充分混匀,倒平板,待冷却后,在培养基中央放置已用拮抗细菌发酵滤液浸泡过的滤纸片,放入28℃恒温培养箱内培养,每处理3 次重复,放置以无菌水浸泡的滤纸片作为对照.当对照长满皿时,测量抑菌圈大小.
　　1.2.3 拮抗细菌的鉴定(1)菌株的形态学及生理生化鉴定,参照文献[7].
　　(2)16S rDNA 序列测定及系统发育分析.16S rDNA的PCR 扩增:采用细菌通用引物[8] (F):5′-GAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′(R):5′-CGGCTACCTTGTTACGACTT-3′进行PCR 扩增.PCR 反应体系:2×PCR-Mixture 12.5 μL,引物各0.5 μL,总DNA 1 μL,dd H2O 10.5 μL,总体积25μL.PCR 的反应条件[9]:预变性,94℃5 min;变性,94℃1min;退火,50℃1 min;延伸,72℃1.5 min;30 个循环后终止延伸72℃10 min;4℃保存.PCR 产物送上海生工生物工程技术服务有限公司测序.
　　系统进化树的构建: 将得到的16S rDNA 序列与GenBank 中的已知细菌序列进行BLAST 比对.并从数据库获取相关种属的模式菌株的16S rDNA 基因序列,与所获得的同源性较高的菌株的16S rDNA 序列采用ClustalX软件进行多序列匹配排列,通过Mega4.0 软件,采用邻位相连法构建系统发育树, 确定待测菌株的分类地位和在系统发育树中的位置.
　　2 结果与分析
　　2.1 拮抗细菌的分离与筛选从采集到的土壤中分离纯化得到687 株细菌菌株.然后以丹尼斯凤梨细菌软腐病病原菌为目标菌, 采用抑菌圈法,分离得到4 株有拮抗作用的细菌.其中抑菌圈大且具有稳定拮抗作用的为A2.
　　2.2 拮抗细菌的抑菌效果与形态特征拮抗效果见图1, 从图1 可以看出,A2的拮抗效果仅次于农用链霉素,具有较好的抑菌效果.其菌落圆形,边缘整齐,不透明,培养3 d 后,菌落表面出现褶皱,呈粉白色.菌株在光学显微镜下观察,为杆状,单生,产芽孢,革兰氏反应为阳性.
　　2.3 菌株A2生理生化特性菌株A2生理生化特性见表1.从表1 可以看出,菌株A2的生理生化特性与枯草芽孢杆菌生理生化特性一致.
　　2.4 菌株A2 系统发育分析拮抗细菌A2的16S rDNA 基因片段大小为1 300 bp左右.用Mega4 软件构建的系统发育树见图2,从图2 可以看出,A2与龙舌兰芽孢杆菌Bacillus tequilensis[10]及枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis 都很接近.根据多相分类原则,综合考虑菌株A2的培养特征、生理生化特性以及16SrDNA 序列比对结果,菌株A2鉴定为Bacillus subtilis.
　　3 结论与讨论
　　化学农药的频繁使用,不仅污染环境,也使得致病菌产生了耐药性, 因此开发对环境无害的生物农药成为当前研究的热点.
　　枯草芽孢杆菌具有抑制植物病害的能力,又是自然界中广泛存在的非致病细菌和植物内生细菌,对人畜无害,是一种较为理想的生防微生物, 可广泛应用于植物病害的生物防治[11].
　　丹尼斯凤梨细菌性软腐病在国内危害严重,筛选具有拮抗作用的微生物防治丹尼斯凤梨细菌软腐病国内尚未见报道, 本研究筛选出一株对丹尼斯凤梨细菌性软腐病有较好拮抗作用的菌株A2, 此菌株分泌具有抗细菌的活性物质,也可能分泌多种抗菌活性物质[12],通过形态特征,生理生化特性以及16S rDNA 序列比对鉴定此菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis.菌株A2对丹尼斯凤梨细菌性软腐病的拮抗效果仅次于农用链霉素的拮抗效果,因此对此菌的进一步研究有重要意义.