肝癌转移复发监测:磁共振扩散加权成像与外周血分子生物学技术研究进展
　　[摘要] 肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)的治疗方法日趋多样化,对治疗后的随访及监测提出了更高的要求.包括MRS、DWI及PWI在内的功能MRI是一种无创性检测方法,可以从局部及整体了解肝脏的代谢、能量及血流等的变化,其在肝脏显像中的不断发展对评价HCC治疗后的疗效及预后有着深远的意义.HCC转移复发是一个多步骤、多因素相互作用的复杂过程.在HCC转移复发的蛋白质组学研究方面,发现了很多新的潜在分子生物学标记物.由于仅用单个指标无法进行准确预测,采用多个指标进行联合检测将是今后HCC转移预测的研究方向.该文旨在揭示肝脏DWI的原理以及目前在辨别肿瘤生物学特性中的作用,评价HCC对治疗的反应,并探索性地提出了DWI在HCC转移复发监测中的应用前景,综述了所涉及HCC转移复发早诊的外周血新型分子标记物.
　　[关键词] 肝肿瘤,肿瘤转移,磁共振成像,生物学标记物
　　长期生存率的关键之一.HCC治疗的发展需要有更精确、更灵敏的影像学方法对其疗效作出评价.近年来,随着MR设备、技术的迅速发展和各种扫描序列的完善,已不满足常规解剖图像的分析,开始了病变功能状态的影像学探讨.MR波谱分析(MRspectroscopy, MRS)、DWI和PWI是三种常用于肝脏的功能成像方法,其在HCC疗效评价中的作用正被越来越多的学者所关注.临床上也迫切需要一些生物学预后指标来监测HCC患者术后转移复发的可能.较早报道的预测指标, 除了临床和病理指标外,还有一些细胞水平的指标.近年来,多集中在蛋白分子指标方面.现将有关的研究进展综述如下.
　　1 MR DWI像技术进展1.1 MR DWI对运动检测敏感的基本特性DWI对活体水分子扩散进行测定,是将宏观流动相位位移成像原理应用于显微水平扩散成像.其在常规扫描序列中加入对称的扩散敏感梯度脉冲,使得在施加梯度场方向上的水分子的相位离散加剧,信号降低.EPI是目前最快的成像方法,在数十毫秒内完成单幅图像信号采集,可以冻结生理性活动的影响,故目前DWI常采用EPI序列采集.
　　1.1.1 扩散梯度扩散梯度的程度由梯度脉冲的强度和持续时间即所谓的梯度因子(gradient factor)决定,用b值表示.由于DWI受到微循环及体内生理运动的影响,实际常采用表观扩散系数(apparent diffusioncoeffi cient, ADC)来代替实际扩散常数.
　　ADC的统计值目前并非完全一样,这可能与样本数、插入b值的多少和大小以及灌注影响程度有关.b值是DWI的扩散敏感度,b值的选择对DWI及ADC值的测量至关重要.当b值较大或b值差大时,ADC值稳定性好,能较好的反映组织内水分子的扩散运动,而微循环对其影响较小;相反,小b值或小b值差在一定程度上反映了微循环的灌注,对水分子扩散反映不及前者,ADC值稳定性也较差[1].在理论上,使用两种不同b值即可获得ADC值或拟合出ADC图像,b值越多,ADC值愈精确,愈接近真实的ADC值[2].
　　1.1.2 DWI及ADC值测量对肝脏良恶性病变的鉴别通过对ADC值的计算从而精确分辨肝脏良恶性病变,一直是众多学者关注的热点.多数研究认为,肝囊肿ADC值最大,血管瘤次之,肝脏良性实质肿块(肝腺瘤、局灶性结节增生)再次之,肝脏恶性肿瘤(原发性HCC、肝转移瘤)最小,这四者的ADC值均与正常肝实质有显著性差异.因此有学者试想提出肝脏良恶性病变的ADC值分界点,其中Kim等[3]提出以1.6×10-3 mm2/s作为分界点,其敏感度为98%、特异度为80%,与Taouli等[4]提出的以1.5×10-3 mm2/s分界点相近,但低于Ichikawa等[5]提出的5.5×10-3 mm2/s,故目前尚未达成共识.而且,良恶性病变之间ADC值仍有交叠,尤其是部分肝实质性良性肿块与HCC、血管瘤与坏死囊变较多的转移瘤之间.
　　1.1.3 DWI对HCC疗效的评价以往对肿瘤治疗后的随访仅限于对病变大小的测量、信号的改变及其强化特征,但事实上,在化疗后的1~2个月内肿瘤的大小并无显著的变化,碘油沉积灶的MRI信号难以辨别,治疗后的强化也有部分来自反应性的肉芽增生.鉴于以上的原因,有学者提出了用DWI对肿瘤行疗效评价的可能性.江新青等[6]用DWI 动态观察带瘤小鼠,将早、中、晚期肿瘤的ADC值进行对比,并与病理相对照,发现随着病程的进展,肿瘤中心的DWI值逐渐升高.而且DWI能够区分肿瘤中的坏死成分和存活成分,坏死组织的ADC值显著高于存活成分,ADC值的改变早于T2WI上信号的改变,甚至早于组织学上的变化.该结果与Chenevert等[7]和Lyng等[8]的研究相符合,且为DWI对HCC疗效评价的可靠性提供了佐证.2000年Geschwind等[9]通过对VX2兔动物模型实验,并经过病理证实,行TACE后的HCC坏死区域其ADC值显著高于存活肿瘤成分;推论这是因为当肿瘤细胞存活时,细胞膜完整而能够限制水分子的扩散;相反,若细胞死亡,细胞膜破裂从而失去对水分子的限制作用,故他认为DWI可对TACE的疗效作出定量及定性评估.2003年Kamel等[10]在人体实验中得到了同样的结论.
　　1.1.4 全身DWI技术在肝内占位病变的应用在以往研究中,曾经有学者利用ADC鉴别肝内局灶性病变.如Moteki T等[11]和Ichikawa等[5]将ADC用于鉴别肝血管瘤与肝细胞癌,指出肝血管瘤ADC值高于肝细胞癌.也有学者更进一步对肝内局灶病变的ADC进行排序.即肝囊肿的ADC最高,依次为海绵状血管瘤及肝实质性肿瘤[12-14].徐贤等[15]最近通过对肝内各种占位病变ADC的比较,结论为:①肝内良恶性病变的比较,以1.6×10-3mm2/s为标准判断病变性质的敏感度和特异度均>90%,故可以以此对肝内病变的性质做出粗略的判断,即若病变ADC>1.6×10-3 mm2/s,则其为良性病变的可能性比较大.而ADC<1.6×10-3 mm2/s时,病变为恶性的可能性较大.②肝内病变ADC排序,肝囊肿的ADC最大,基本可以认为若病变的ADC在3.0×10-3 mm2/s以上,则其为囊肿的可能性比较大;其次为肝血管瘤及实质性肿瘤(包括转移瘤及原发性HCC),这与前人所测得的结果相吻合.基本可以通过ADC鉴别肝囊肿及其他病变.③肝血管瘤及转移瘤、原发性HCC的ADC比较,通过对上述3种病变ADC的测量,发现肝转移瘤的ADC波动较大,这可能与其组织起源不同有关;肝血管瘤、转移瘤及原发性HCC的ADC之间有一定程度的交叉,尤其是后两者之间的重叠程度较大.为了进一步鉴别上述病变,该研究进一步比较了各病变ADC病变/ADC肝脏比值.
　　得出血管瘤、转移瘤及原发性HCC与肝脏的比值依次递增.这可能与原发性HCC多在肝硬化基础上发生,而血管瘤及肝转移瘤则多发生于正常肝实质有关.这一结果或许可以成为鉴别肝内实质性病变的一种新的方法.此外STIR-EPI良好的背景压制效果使MIP三维重组的优势得以最大程度地发挥.病变周围组织信号被压制后,病变部位得以清楚显示,利于对肿瘤分期并判断预后.背景信号抑制DWI技术在腹部肝脏占位病变的诊断方面有较高的临床应用价值.
　　2  外周血分子生物学技术研究进展
　　2.1 外周血肿瘤细胞的检测早期检测出外周血中的肿瘤细胞,对及早有效的综合治疗具有重要的临床意义.血行转移是HCC的主要转移途径,但血行转移的诊断仍然存在困难,主要是没有找到能准确反映早期微转移的肿瘤相关因子.近年来发现磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因(Glypican-3 mRNA)、骨桥蛋白(OPN)、碱性成纤维生长因子(bFGF)、PGE2、类表皮生长因子(EGFL)7、AFP mRNA、AFP-L3与HCC血行微转移有密切的关系,而传统检测HCC的标记物AFP、AFU、GGT2、AP、AIF、ALD-A、5'-NPDV、VEGF等依然在HCC的检测中有着重要意义.现将目前HCC外周血分子生物学检测的主要相关因子做一概述.
　　2.2 Glypican-3 mRNA2.2.1 Glypican-3 mRNA的概述Glypican-3即磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3基因,是一种膜性硫酸乙酰肝素糖蛋白(HSPG), Glypican-3结构特殊,影响多种生物效应分子,对组织、器官的发生、发展起关键的调节作用,几乎在所有人类HCC和黑色素瘤细胞上表达,而在胎盘和胎肝以外的正常组织不表达.Glypican-3在HCC中过表达,而在成人正常组织(如肝、肺、肾、心、脑、脾、胃、小肠、大肠、睾丸、膀胱及胰腺中亦均不表达[16])、癌旁组织、肝炎、肝硬化组织中仅低表达或不表达.Zhu等[17]证实Glypican-3 mRNA在正常肝组织、肝灶性结节状增生、肝硬化中低表达或不表达;相反在研究的30例HCC患者中有20例显著表达,在5例中适度表达.Glypican-3在患者HCC中的表达相对于在正常肝组织中的表达增加,差异有统计学意义.
　　Glypican-3被认为是HCC表达比较特有的基因.
　　2.2.2 Glypican-3 mRNA的检测意义柏凯等[ 1 8 ]通过检测原发性HCC患者外周血Glypican-3,结果发现外周血Glypican-3 mRNA检出率与肿瘤直径、癌结节数目、临床TNM分期、门静脉癌栓、肝外转移明显相关(P <0.05).Ⅰ、Ⅱ期患者阳性率为36%,远较Ⅲ、Ⅳ期患者阳性率(76%)低(P <0.05).说明原发性HCC早期即表现为全身性疾病,可以发生肿瘤细胞的血液性播散.
　　随着临床分期的增加,外周血单核细胞Glypican-3mRNA检出率有增高的趋势,提示动态观察外周血中Glypican-3 mRNA表达有助于判断HCC患者的预后.这和Nakano等[19]报道的即使直径<2 cm的高分化肝细胞癌,肿瘤细胞也可能侵蚀血管壁形成血行微转移的结果基本相符.Glypican-3 mRNA在门静脉癌栓的患者中表达高达90%,肝外转移患者的外周血单核细胞Glypican-3 mRNA 100%阳性.表明随着肿瘤逐渐进展,发生转移的可能性增大.唐浩等[20]对大鼠肝细胞癌模型进行研究,认为外周血Glypican-3mRNA的阳性率与HCC微转移的发生有明显的相关性,且高于AFP mRNA的阳性率,有望成为HCC微转移新的诊断指标.Ding等[21]报道,41例AFP阴性的HCC中,有30例为Glypican-3 mRNA阳性,表达率为73%.因此Glypican-3 mRNA在HCC的早期发现、转移及预后中有重要价值,并可望成为HCC特别是AFP阴性时HCC的一个新的基因标志.
　　3 OPN
　　3.1 OPN的概述OPN即骨桥蛋白(osteopornin),是一种分泌性磷酸化糖蛋白,以多种亚型存在于细胞内外,结构上它与多种基质蛋白相似,功能上它具有细胞因子的特点,参与机体多种病理过程.OPN含有特异的与细胞黏附有关的RGD(Arg-Gcy-Asp)序列,通过与其受体整合素、CD44等结合来促进细胞的趋化黏附和迁移,从而介导肿瘤细胞的侵袭转移[22].OPN及其相关分子与肿瘤转移的关系密切.通过转录因子与OPN启动子的应答元件(RAE序列、Tcf-4结合序列、AP-1结合序列、RE-1序列等)相互作用,调控OPN的表达.OPN通过促进肿瘤细胞黏附、激活生长因子受体、促进血管生成等多个环节参与肿瘤转移过程[23].
　　3.2 OPN的检测意义OPN参与了包括HCC在内的多种恶性肿瘤的增殖和转移.Man等[24]报道,在103例人肝细胞癌病例中69例HCC组织中OPN基因表达水平高于癌旁组织, 其中58例超过2 倍以上,HCC和癌旁组织中OPN平均表达水平差异具有统计学意义(P <0.001);而在大鼠HCC模型中,随着HCC的发生和发展OPN表达水平逐渐上升,可见OPN在HCC组织中高表达,且随着HCC血行转移而逐渐升高.崔伯康等[25]的研究中,HCC复发组血浆OPN浓度为(961.0±411.6) μg/L,复发组与无复发组血浆OPN浓度差异有统计学意义(P =0.039).可见HCC患者血浆中OPN浓度可以作为预测HCC复发转移的参考因子.陆健等[26]认为OPN在HCC组织中显著高表达,且和早期复发血行微转移相关,OPN可能参与了肿瘤血管生成的过程.因此检测OPN有助于HCC的诊断和复发预测.
　　4 bFGF
　　4.1 bFGF概述研究表明,bFGF是一种强力的促血管生成因子,在多种恶性肿瘤尤其是转移性肿瘤患者的血和尿中bFGF显著升高[27].Nanus等[28]报道,在肾癌患者中bFGF表达升高患者预后不良.Dirix等[29]和Barton等[30]报道,在结、直肠癌、乳腺癌、宫颈癌和肾癌患者中,血清bFGF水平与肿瘤转移复发显著相关.由于HCC切除术后患者生存时间能较准确地反映HCC切除术后的转移复发,选择HCC大小和肝内有否播散,作为划分高、低转移复发倾向组的标准.
　　4.2 bFGF的检测意义血清bFGF水平升高超过200 pg/L,作为根治性切除术后HCC转移复发预测指标,有较高的灵敏度和特异度.结果提示,bFGF可能是预测HCC根治性切除术后转移复发的较灵敏有效指标.一旦HCC侵袭转移便释放bFGF进入邻近组织和血循环,促成肿瘤的血管生成,从而形成肝内、外转移而致复发.HCC侵袭转移高度依赖肿瘤血管生成.同时,bFGF水平升高也反映了HCC高度侵袭转移的生物学特性.
　　5 PGE2
　　5.1 PGE2概述PGE2是花生四烯酸(arachidonic acid, AA)的主要代谢物之一,细胞内PGE2的产生主要涉及磷脂酶A2、COX、PGE2合成酶(PGES).PGE2通过刺激诱导肿瘤血管增生,抑制局部免疫功能,调节多种信号传导途径而影响细胞的增殖,促进肿瘤细胞的生长[31].mPGES-1是合成PGE2的限速酶,mPGES-1仅为炎性刺激诱导所产生[32],而且上游酶是COX-2.
　　mPGES-1与COX-2协同作用催化AA异构转化为PGE2,介导PGE2的即时合成和迟发合成,因此具有重要的生理和病理作用[33].
　　5.2 PGE2的检测意义通过测HCC患者肿瘤组织和外周血PGE2水平、肿瘤组织中mPGES-1和HBx表达,发现肿瘤组织PGE2含量明显高于癌旁肝组织,外周血中PGE2含量随着肿瘤组织PGE2含量增高而增高,并且肿瘤组织和外周血的PGE2的水平变化均与HCC分化程度和术后是否复发转移相关.这些研究结果提示可以通过检测HCC患者外周血的PGE2水平来辅助评估HCC复发转移的情况.研究结果还显示HCC组织mPGES-1表达水平显著高于癌旁肝组织,与外周血PGE2含量以及HCC组织中HBx表达均呈正相关,并且与肿瘤术后复发转移密切相关.由于mPGES-1在炎症细胞因子刺激下表达可明显增高,并PGE2产量可随着COX-2表达的增高而成倍增加[34].另外有研究表明,将COX-2和mPGES-1共同转染到人胚肾细胞HEK239可导致细胞转化,接种到裸鼠可导致肿瘤形成[35];动物实验亦证实抑制PGE2可以抑制肿瘤转移[36];将mPGES-1抑制剂或特异性的干扰片段导入人结肠癌细胞株HCA-7可致细胞增殖显著降低、PGE2产量显著减少[35].HBx和mPGES-1可能成为阻止HCC发生发展的新靶点.
　　6 EGFL 7
　　6.1 EGFL 7概述类表皮生长因子7(epidermal growth factor-likedomain 7, EGFL7)又称为VE-statin、Neul、Notch4-1ik等,属于分泌型蛋白.新近的研究发现,其涉及血管形成过程中成管这一关键性的步骤,在生理性和病理性血管的管腔形成、功能完善上发挥着重要作用,它的表达改变将影响血管的新生[36].因此EGFL7已成为当今肿瘤治疗研究的一大热点.
　　6.2 EGFL7的检测意义目前已知EGFL7基因属于一个小基因家族,编码产物为含273AA的分泌蛋白,由内皮细胞及其原始细胞分泌产生.EGFL7因子被血管内皮细胞(EC)分泌后停留在EC附近,表明其可能跟细胞外基质相关,介导细胞间相互作用.用放射原位杂交检查EGFL7的表达谱后发现:在血管生长和塑型活跃的肿瘤组织,EGFL7的表达呈显著上调[37-38]这表明血清EGFL7可显著提高AFP阴性HCC患者术后复发转移的检出率.HCC患者术后血清EGFL7水平的动态监测对诊断HCC术后复发转移具有重要的价值,EGFL7有望成为监测HCC术后复发转移新的血清学诊断标记物[39].
　　7 AFP mRNA及AFP-L3
　　7.1 AFP mRNA及AFP-L3的概述AFP是由Bregstrand等于1956年首次发现的血清蛋白成分,1963年Abelev等首先报道了它与肝细胞的密切关系.在正常情况下,这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞,胎儿出生约2周后甲胎蛋白从血液中消失,因此正常人血清中AFP的含量尚不到20 μg/L.
　　当干细胞或生殖腺胚胎组织发生恶性病变时,有关基因重新被激活,使原来已丧失合成AFP能力的细胞又重新开始合成,以至血中AFP含量明显升高,而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加,AFP就成了诊断原发性HCC的一个特异性临床指标.HCC的AFP阳性率为70%~90%.在生殖腺胚胎瘤、少数转移性肿瘤如胃癌以及孕妇、肝炎、肝硬化中AFP可呈假阳性,但升高不如HCC明显.利用RT-PCR技术检测HCC患者外周血中AFP mRNA即甲胎蛋白信使核糖核酸的表达,AFP mRNA在健康志愿者、非HCC恶性肿瘤患者外周血中均为阴性;在肝细胞癌组外周血中AFP mRNA的检出率明显高于对照性乙型肝炎或肝硬化组.AFP mRNA检出率与临床分期、门静脉癌栓、肝外转移显著相关.AFPL3是AFP三种异质体之一,通常AFP可分为三种异质体,即AFP-L1、AFP-L2、AFP-L3.AFP异质体是AFP不均一的糖链异质性,即氨基酸序列相同而糖链不同的AFP.
　　7.2 AFP mRNA及AFP-L3的检测意义AFP仍是目前国内大多数医院诊断HCC的主要指标,陈克林等[40]采用逆转录和巢氏多聚酶链式反应及Southern杂交技术以检测HCC患者有无血行微转移,AFP mRNA的阳性率为61.5%.舒宏等[41]采用AFP mRNA作为外周血HCC手术后血行微转移的标记物,AFP mRNA的阳性率为56.7%.因此可以认为AFP mRNA可作为定性诊断原发性HCC的血液学指标,也可作为HCC细胞血行微转移的标记物,并可判断HCC临床分期、转移倾向、预后和复发[42].AFPvariants中尤以AFP-L3与小扁豆凝聚素的亲和力高,其主要存在于HCC细胞中,Li等[43]指出AFP-L3在诊断HCC方面是一个高特异性指标,并且AFP-L3受慢性肝病等的影响小.Ando等[44]研究发现,35%早期HCC患者中可检测出AFP-L3,并指出AFP-L3在早期HCC检测中有重要意义.因此AFP、AFP mRNA及AFP-L3在HCC的早期诊断、分期及预后中有着重要意义.
　　综上所述,DWI是无创性研究人体内部器官、组织代谢、生理变化改变的定量分析方法.根据DWI信号强度诊断全身各个部分的病变敏感性高,结合ADC定量测量具有较高的鉴别诊断价值.DWI检查覆盖范围大(从头颅至膝关节)、检查时间短、费用低.尽管对病灶诊断的特异度欠佳.但具有较高的敏感度.非常适用于健康体检及恶性肿瘤全身转移的筛查.利用3D-MIP重组和黑白反转技术能够三维显示原发灶和转移灶.达到类似PET的图像效果,有利于临床医师解读,具有重要的临床价值.然而DWI技术仍存在许多不足之处,如体线圈长度的限制和移床的限制,不能无限制地增加扫描长度.国内多家医院所做的扫描并非严格的全身成像,而是从头到膝关节的成像,所以称大范围DWI扫描;视野(FOV)越大,匀场效果越不好,因而国内多家医院采用的FOV为36 cm×36 cm的6段扫描法.对于体形较宽的患者不能包括双上肢.随着3.0 T MRI的出现,SNR得到了改善,但匀场的时间相对较长,可能会增加患者接受扫描的整体时间.再如颈部图像质量较差、心脏大血管搏动伪影易漏检相应部位病变,胃肠道高信号干扰邻近器官的显示和病灶的判断,小的病变尤其是直径<1 cm者,有可能因为自由呼吸而遗漏.背景信号较高的脏器(如脾脏、双肾等)其病灶易被掩盖.段之间信号强度的差异会影响重组后图像的视觉效果等.这些不足对软、硬件的发展提出了一定的要求,是下一步DWI技术发展要克服的问题.
　　要解决HCC的转移复发,重点是要有效地预测和预防.近年来,肿瘤转移机制的研究进展提示转移可能是肿瘤发生中的早期事件[45].通过高通量蛋白芯片和蛋白质组学等技术获得一些高复发HCC的分子标签,在新的HCC转移复发标记物的研究方面已经有较大的进展.建立HCC转移的多分子预测模型,经大量临床标本进一步验证,尤其是前瞻性规模化验证和加速临床应用将是今后的主要的趋势和研究重点[46].对具有转移复发倾向的HCC患者进行有效干预,对进一步提高HCC患者的治疗效果、改善预后具有非常重要的临床意义.